小鼠原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)

小鼠原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)準(zhǔn)備材料能夠提供灌注速度為1-10mL/分鐘的蠕動(dòng)泵（我們用的是保定蘭格的蠕動(dòng)泵，某寶有售）；能夠容納50-100mL溶液的無菌容器；凹槽（可供放置操作臺(tái)面并提供引流槽，我們用的是搪瓷實(shí)驗(yàn)盤+泡沫板的組合）；可維持37°C的水浴設(shè)備（即恒溫水浴鍋）；無菌100mL廣口玻璃瓶；無菌50mL錐形管；一次性或可重復(fù)使用的70微米不銹鋼過濾器（就是不銹鋼濾網(wǎng)，查閱資料提示這里選用的濾網(wǎng)規(guī)格大概為200目左右）；細(xì)胞培養(yǎng)皿（直徑10cm，即常說的大皿）；無菌器械，至少要有一把剪刀和兩對(duì)細(xì)尖鑷子；10.70%-75%酒精和去污劑（去污劑我們沒有用過，只要小鼠備皮充分一般影響不大），均盛裝于噴霧瓶中（碘劑可選）；麻醉劑，注射或吸入劑型均可（我們選用水合氯醛或戊巴比妥）；Vacutainer牌蝶型插管（我們選用BD公司的套管針）；推薦小鼠體重：20g-40g（我們的建議是25g以上）；口罩；每只小鼠2只吸水臺(tái)墊（我們是用大量吸水紙代替吸水臺(tái)墊鋪在手術(shù)操作平臺(tái)上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；動(dòng)物操作臺(tái)；膠帶。分離試劑前灌液：Hank's緩沖鹽溶液（HBSS），使用不含鈣鎂離子、含0.5mMEGTA的1x工作液；共需要大約60ml-70ml；使用前預(yù)溫至37C；后灌液：IV型膠原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mMHEPES（低糖DMEM和IV型膠原酶是必須的，HEPES緩沖液等等可以選擇性加入）；共需要90ml。注意確保所使用的DMEM含鈣；使用前預(yù)溫至37C；分散液：IV型膠原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4C預(yù)冷；4.IV型膠原酶;在消化液和分散液中，膠原酶的濃度至少要達(dá)到100膠原酶消化單位/ml（100CDU/ml）；（我們使用的是購(gòu)自Gibco公司的IV型膠原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝細(xì)胞）；蒸餾水。材料和試劑1.鼠尾膠原（I型膠原蛋白）；BD#354236（我們用的是杭州生友公司的I型鼠尾膠原，效果不錯(cuò)）；2.0.02NAcAc,無菌過濾，用于稀釋I型膠原；以膠原包被培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板，使用前無菌1XPBS沖洗；4.0.4%臺(tái)盼藍(lán)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。分離前準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備好所有必要的試劑（詳細(xì)的試劑和耗材清單如上）；最好在無菌環(huán)境中分裝膠原酶，輕柔渦旋，并在37°C環(huán)境下使膠原酶溶解30-60分鐘。注意，雖然膠原酶溶解迅速，充分溶解30分鐘以上的膠原酶具有更加穩(wěn)定的消化效率（基于細(xì)胞總產(chǎn)量）。此時(shí)可以將HBSS（即前灌液）置于水浴鍋中預(yù)溫。準(zhǔn)備好動(dòng)物試驗(yàn)臺(tái)。如果能提供無菌環(huán)境當(dāng)然是最好的，但是最開始的幾個(gè)操作步驟并不要求采取嚴(yán)格的無菌措施。所有非多孔表面需要噴灑70%-75%酒精消毒。蠕動(dòng)泵管道用70%-75%乙醇循環(huán)運(yùn)行消毒至少20分鐘，隨后用雙蒸水漂洗兩次以去除殘留的乙醇。確保用于實(shí)驗(yàn)操作的平臺(tái)已經(jīng)完成充分的清洗和消毒。準(zhǔn)備兩個(gè)吸水臺(tái)墊，其中一個(gè)置于工作臺(tái)面上，另一個(gè)覆蓋在操作平臺(tái)上（如硬紙板或泡沫塑料）。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)采用的是非循環(huán)灌注，所有的灌注液體都將隨用隨棄，因此建議采用凹槽式的結(jié)構(gòu)，這樣廢棄的液體可以流入凹槽中，避免在灌注過程中造成各種不必要的麻煩。如果有需要，可以將操作平臺(tái)放入淺壁容器內(nèi)（淺壁容器可以臨時(shí)盛放灌注后的廢棄液體）。這種措施對(duì)于小鼠灌注是選擇性使用的（一方面需要操作平臺(tái)需要提供足夠的支撐強(qiáng)度，另一方面小鼠的灌注量相對(duì)較少，吸水墊基本可以將廢棄的灌注液完全吸收），但對(duì)于大鼠的灌注則可能是必要的（因?yàn)榇笫蠊嘧⒌臈壱毫窟h(yuǎn)遠(yuǎn)多于小鼠）。將一個(gè)10cm培養(yǎng)皿（無菌）置入操作臺(tái)中，用來盛放灌注結(jié)束后游離下來的肝臟。如果使用非一次性雙層75微米過濾器（即濾網(wǎng)），確保它已預(yù)先完成無菌處理。以下物品置于冰上預(yù)冷：盛有分散液的容器（即預(yù)冷分散液）；50ml無菌錐形管。確保下列物品為預(yù)溫的：HBSS（即前灌液）；消化液/膠原酶（即消化液）。準(zhǔn)備好套管針。在原代分離即將開始前，用HBSS（即前灌液）預(yù)充蠕動(dòng)泵的管道，確保灌注系統(tǒng)中無氣泡，尤其要注意蠕動(dòng)管之中不要有氣泡。如果蠕動(dòng)管中出現(xiàn)氣泡，則需要保持蠕動(dòng)泵運(yùn)轉(zhuǎn)直到使氣泡排出，不要在乎因此失去的幾毫升前灌液。在調(diào)校好蠕動(dòng)泵并確保沒有肉眼可見的氣泡后，將蠕動(dòng)泵流速調(diào)節(jié)至緩慢（1?2ml/min）后關(guān)閉。至此，分離前的準(zhǔn)備工作完成。

插管，灌注、消化麻醉小鼠。推薦異氟烷，因?yàn)樗鼘?duì)肝臟代謝的影響最?。l件所限，我們采用腹腔注射戊巴比妥或水合氯醛的方式進(jìn)行麻醉，注意避免刺傷內(nèi)臟器官）。腹部向上將小鼠固定于工作平臺(tái)上；膠帶或大頭針固定四肢。為盡量減少因痛苦導(dǎo)致的麻醉動(dòng)物過早蘇醒，膠帶是首選。徹底清潔腹部和胸部區(qū)域，用乙醇或碘劑消毒。此步驟既要求迅速又要求消毒徹底，因?yàn)閯?dòng)物的毛皮是第一個(gè)潛在的污染源。如果動(dòng)物有排便，一定要清理和消毒沾染糞便的區(qū)域。用剪刀和直鉗取下腹部切口，剪開表皮和肌肉層，盡量直接切至肌肉層（因此建議選用鋒利的剪刀）。注意不要刺傷任何臟器，尤其是腸道。剪皮時(shí)提起皮膚的邊緣，減少傷及臟器的風(fēng)險(xiǎn)。繼續(xù)直線開腹直到肝臟、門靜脈（PV）和下腔靜脈（IVC）充分暴露。最后一刀停留在腹左側(cè)（施術(shù)者左側(cè)）近臍部，方便后續(xù)灌流時(shí)血液的排出。啟動(dòng)蠕動(dòng)泵（此時(shí)應(yīng)已設(shè)定為緩慢灌注模式），等待套管針前端有液體流出后，伴隨著液體的流出，迅速地并一氣呵成地將套管針置入門靜脈中。如果置管成功，肝臟應(yīng)迅速變白，一旦確認(rèn)插管成功，當(dāng)立即剪斷下腔靜脈釋放系統(tǒng)（門靜脈-肝臟-下腔靜脈）壓力，并且注意使灌注液自鼠體左側(cè)流出腹腔（強(qiáng)烈建議有助手協(xié)助來完成此步驟）。一旦下腔靜脈被剪斷，肝臟將不再變白，而是變的顏色暗淡。在明亮的直射光下比較容易觀察到肝臟變白的情況。如果肝臟沒有立即變白，尤其是在下腔靜脈已經(jīng)剪斷之后仍未變白，最常見的兩個(gè)錯(cuò)誤是：存在隱匿性的氣泡阻塞，或者操作者失誤（如勿入胰管而未能準(zhǔn)確將針置入門靜脈）。前者更為常見，因此在插管時(shí)建議持續(xù)低流速泵注HBSS（前灌液），液體的持續(xù)流出可以消除隱匿在套管針傘部或其他不宜觀察到的部位的氣泡）?；蛘?，也可以采用下腔靜脈插管、剪斷門靜脈的方法逆行灌注°Klaunig等人（1980）發(fā)現(xiàn)門靜脈插管灌注將獲得更高的細(xì)胞得率，雖然二者差別并不是特別大，所得細(xì)胞的存活率也并無顯著差異。而且由于下腔靜脈的管徑明顯粗大，從下腔靜脈穿刺置管顯然更加容易。但我們的經(jīng)驗(yàn)還是建議門靜脈插管，下腔靜脈引流。當(dāng)剪斷下腔靜脈后，立即將灌流速度加大到7-9ml/min，讓所有HBSS通過肝臟灌注，流速可以1-2ml/秒的速度遞增（建議讓助手監(jiān)控并調(diào)節(jié)流速）。通過對(duì)下腔靜脈輕輕施加壓力可以快速檢測(cè)穿刺置管是否成功，在灌注速度大于8ml/min時(shí)，所有的肝葉會(huì)立即開始膨脹。當(dāng)盛放HBSS（前灌液）的容器（不是蠕動(dòng)泵的管子）中液體即將耗盡時(shí)，向容器中倒入70ml消化液（含酶消化成分），沒必要而且不建議在此過程中停止運(yùn)行蠕動(dòng)泵。很明顯容器中殘存的HBSS會(huì)稍稍稀釋最開始灌注時(shí)的膠原酶的濃度，但這并無大礙。將剩余的大約20ml消化液倒入10cm培養(yǎng)皿中并迅速蓋上皿蓋，這一步要求迅速（同樣的，該步驟可以在助手的幫助下變得非常高效）。一個(gè)增加細(xì)胞得率并且減少總消化時(shí)間的小技巧是定期按壓下腔靜脈（在灌注時(shí)可以進(jìn)行5-10次，每次按壓約5秒鐘，即暫時(shí)阻斷灌注液的排出通道），這種方法可以使肝臟反復(fù)膨脹，肝內(nèi)增加的壓力有助于肝臟的消化，從而提高產(chǎn)率（強(qiáng)烈建議將此操作納入標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行）。隨著消化過程的進(jìn)行，可逐漸觀察到肝臟緩緩膨脹，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因應(yīng)該是膠原酶破壞了肝內(nèi)彈性纖維。當(dāng)這種腫脹出現(xiàn)時(shí)，就意味著已經(jīng)非常接近消化結(jié)束了。注意，如果執(zhí)行了步驟8，即通過定期按壓下腔靜脈來觀察肝臟隨著對(duì)門靜脈壓力的施加與釋放發(fā)生膨脹或收縮，則不能使用步驟9的方法來判斷肝臟的消化進(jìn)程。因此，如果此時(shí)要評(píng)估肝臟消化程度，可以遵循如下原則：隨著消化過程的進(jìn)行，在每一個(gè)下腔靜脈施壓和釋放循環(huán)結(jié)束后，肝臟的回縮程度都會(huì)因?yàn)閺椥缘钠茐亩鴾p小。沒有確定的標(biāo)準(zhǔn)來判斷消化是否已經(jīng)完成，一般而言，一旦肝臟開始膨脹，再進(jìn)行1-3min的灌注消化就足夠了，在肝下葉或許會(huì)看到小的清亮透明的部分。肝臟可能出現(xiàn)濕透的條級(jí)布樣紋理。讓肝臟消化到何種程度幾乎完全取決于你可以在何種程度上熟練地切除器官。如果使用的膠原酶消化條件比較溫和，延長(zhǎng)1-2min的消化時(shí)間并無大礙。當(dāng)消化效果滿意后，關(guān)掉蠕動(dòng)泵并小心地拆下套管。肝細(xì)胞提取和純化用直鑷小心理順各個(gè)肝葉并暴露出肝臟的中央部位。找到連接各個(gè)肝葉的纖維束，換用彎鑷鉗夾這個(gè)較為結(jié)實(shí)（安全）的纖維束聚集部位。這一步操作要穩(wěn)，不能急躁，因?yàn)檎覝?zhǔn)這個(gè)點(diǎn)可以為完整的分離肝臟提供了堅(jiān)實(shí)的保障。抓穩(wěn)肝臟后，將肝臟稍稍拉向你（嘗試在肝臟后面，即靠近胸腔的一側(cè)游離出肝臟的各個(gè)肝葉），暴露胸腔和連接肝的各種結(jié)締組織。小心仔細(xì)地切斷這些連接，慢慢地把肝臟向前和向外游離。這一步可能需要更換新的剪刀，因?yàn)榇饲暗囊话鸭舻犊赡芤呀?jīng)沾染了小鼠的血液和毛皮。此時(shí)同樣需要注意小心操作，避免傷及任何內(nèi)臟器官。—旦足夠的結(jié)締組織連接被切斷，適當(dāng)?shù)氖┝涂梢詫⒏闻K完全游離出小鼠的腹腔。不需要撕開膽囊，但如果你想去除膽囊，那就在此時(shí)將膽囊去除。立即將肝臟浸入盛有消化液的10cm培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子（助理完成）。此步驟完成后我們建議轉(zhuǎn)移至細(xì)胞臺(tái)（或生物安全柜）中按照嚴(yán)格無菌的要求繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)操作。使用2副鑷子（要么是新的無菌鑷，要么將之前的鑷子用酒精和/或火焰處理之后再用），撕裂肝葉；如果此前沒有去除膽囊，則此時(shí)應(yīng)避免弄破膽囊。如果此前肝臟消化良好，此時(shí)應(yīng)該看到分散液隨著肝臟的撕裂而變渾濁，肝臟可以大部分溶解在分散液之中。在理想情況下，殘存下來的都是結(jié)締組織殘?jiān)?，但?shí)際操作時(shí)通常會(huì)有一些肝葉也殘存下來。如果撕裂肝臟后，大塊的肝葉都沒有被消化，在分散液中幾乎沒有形成云霧狀渾濁，那就是消化過程中出了問題。將肝臟撕開后，用鑷子夾住肝臟的中央部位（剛剛的纖維束點(diǎn)），輕輕搖動(dòng)以分散殘留的細(xì)胞。丟棄所有殘留的固體顆粒，包括膽囊（如果你選擇不在步驟3中剔除它，膽囊在此過程中應(yīng)保持完整；如果膽囊破裂，則說明你的力量過大或鑷子不慎刺破了膽囊）。理論上膽囊的破裂不會(huì)對(duì)肝細(xì)胞活力或功能產(chǎn)生任何不良影響，但有關(guān)這一點(diǎn)目前尚無實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此，為了保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性，建議盡量避免膽囊破裂。提示：此時(shí)所有涉及肝細(xì)胞處理的步驟必須使用無菌器材并且動(dòng)作要輕柔。此時(shí)的肝細(xì)胞非常脆弱，并且易受剪切力的損傷。用25mL移液器在原10cm培養(yǎng)皿中吹打懸浮液三次（我們使用的是巴氏管，注意輕柔吹打）。如果使用不銹鋼過濾網(wǎng)，此時(shí)應(yīng)注意將過濾網(wǎng)的底部預(yù)濕，或者可以在開始撕裂肝臟之前就預(yù)先潤(rùn)濕濾網(wǎng)的底部。操作很簡(jiǎn)單，將2-3ml分散液涂布到過濾器的底部，輕輕旋轉(zhuǎn)過濾器直到整個(gè)底面濕潤(rùn)即可，丟棄殘余的液體。通過70-75^m濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸浮液。如果使用過濾器，您的細(xì)胞將存留在95毫米皿中；將其轉(zhuǎn)移到無菌、干凈的50mL錐形管中。若使用獵鷹管過濾器，此時(shí)您的細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)入50mL錐形管內(nèi)并準(zhǔn)備使用。在蕩平式離心機(jī)中以50Xg、4°C離心2分鐘。離心機(jī)可不必預(yù)冷，但預(yù)冷的效果更好。用無菌巴氏管吸棄上清（混濁、不透明，上清內(nèi)主要是間質(zhì)細(xì)胞和部分細(xì)胞碎片，如果需要同時(shí)分離提取間質(zhì)細(xì)胞，比如星狀細(xì)胞之類的，可以用此步驟的上清繼續(xù)分離），加入25mL冷培養(yǎng)基。輕輕吹打幾次以溶解底部的細(xì)胞團(tuán)，并重懸。重復(fù)步驟9和10兩次以上，共洗滌3次。第二次洗滌后上清應(yīng)接近透明，第三次洗滌后上清應(yīng)完全清亮。最后一次離心完成后，吸棄上清并加入25-45mL冷培養(yǎng)基。保持足夠的細(xì)胞懸液濃度，這樣就不必在細(xì)胞鋪板之前重新離心，但也不要使細(xì)胞懸液濃度過高，以免造成計(jì)數(shù)困難。巴氏管輕柔重懸細(xì)胞。用移液器吸取80uL重懸后的細(xì)胞懸液用于計(jì)數(shù)和臺(tái)盼藍(lán)染色。染色，定量和鋪板向80uL細(xì)胞懸浮液中添加20uL0.4%的臺(tái)盼藍(lán)。上下?lián)u動(dòng)幾次使其與細(xì)胞懸液充分混合。室溫染色約1min0再次輕柔吹打數(shù)次，吸取10uL懸液滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上。顯微鏡下計(jì)數(shù)所有未藍(lán)染、非空泡樣細(xì)胞。注意臺(tái)盼藍(lán)超強(qiáng)的活力（盡快完成計(jì)數(shù)）。值得一提的是：被染色的細(xì)胞當(dāng)然是已經(jīng)掛掉的，但未染色的細(xì)胞也可能已受到損傷或?yàn)l死。我們的經(jīng)驗(yàn)是，活的、健康的肝細(xì)胞具有明亮，清澈，平滑的外觀，相對(duì)較小并且有聚集性。受損、死亡的細(xì)胞通常腫脹并且看起來粗糙、呈顆粒狀。準(zhǔn)備進(jìn)一步培養(yǎng)的肝細(xì)胞活力應(yīng)至少超過85%，以確保不同實(shí)驗(yàn)批次間的一致性。一般而言8-12周齡的C57小鼠，每只可分離出的原代肝細(xì)胞總產(chǎn)量在3000-5000萬個(gè)。平均產(chǎn)量應(yīng)該約為4000萬，產(chǎn)量低于3000萬/鼠表明操作過程出錯(cuò)（很可能要?dú)w咎于消化/插管不當(dāng)）。在計(jì)數(shù)細(xì)胞后（注意校正因臺(tái)盼藍(lán)造成的25%的稀釋），對(duì)鋪板細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋。稀釋終濃度一般是預(yù)估每10mL總體積種1個(gè)板，其中含后300萬活細(xì)胞；或使細(xì)胞濃度為300,000個(gè)/mLo推薦的鋪板細(xì)胞量：10cm培養(yǎng)皿：8mL（7-9mL均可）6孔板：1.7mL/孔（1.5-2.0mL均可）12孔板：800uL/孔（700-820uL均可）24孔板：360uL/孔（340-450uL均可）現(xiàn)已證實(shí)這些推薦鋪板體積和濃度可以獲得最一致的鋪板結(jié)果，因?yàn)樵谏鲜鰲l件下細(xì)胞向中央或邊緣聚集的趨勢(shì)最小化。在所有細(xì)胞鋪板之前，建議先鋪一個(gè)孔/