第十三章基因工程

第十三章基因工程第1頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第十三章基因工程（GeneEngineering）在各種酶的作用下，將目的基因的DNA分子與載體DNA分子相連接，形成重組的DNA分子，以一定的方式導(dǎo)入原無該類分子的宿主細(xì)胞，并使宿主生物變?yōu)樽匀唤缭瓉頉]有并能連續(xù)傳代的新生物。要點(diǎn)：供體、載體、受體基因工程分狹義（上游）：重組、克隆、表達(dá)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建。廣義（下游）：表達(dá)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)物的純化。目的：DNA擴(kuò)增，外源基因表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)調(diào)控，改造生物遺傳特性等。第2頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三基因工程限制性內(nèi)切酶和載體是基因工程的眾多理論與技術(shù)基礎(chǔ)中最重要的基石。基因工程的基本步驟可概括為：目的基因的獲得(基因克隆)；目的基因與載體連接(DNA分子重組)；重組DNA分子導(dǎo)入受體；轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定。第3頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三限制性內(nèi)切酶與DNA連接酶細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)特異性降解外源(異源)核酸分子的核酸酶。其作用：特異性降解異源DNA分子(甲基化修飾差異)；I類限制酶隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，II類限制酶識別、切割特殊的回文(對稱)序列；II類限制酶交錯(cuò)切割DNA雙鏈，產(chǎn)生粘性單鏈末端。來源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA連接酶的作用下可準(zhǔn)確連接成重組DNA分子。通常使用來自T4噬菌體DNA連接酶。重組DNA技術(shù)是基因工程最核心的技術(shù)。第4頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三載體(vector)用于承載、克隆、轉(zhuǎn)移目的基因(DNA片段)，能自我復(fù)制的DNA分子。在基因克隆時(shí)：將目的片段轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制克隆——克隆載體；在基因?qū)胧荏w時(shí)：將目的片段轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中并進(jìn)行使之表達(dá)——轉(zhuǎn)化載體或表達(dá)載體。常用基因工程載體有：細(xì)菌質(zhì)粒(克隆)；λ噬菌體(克隆)；柯斯質(zhì)粒(克隆)；穿梭質(zhì)粒(克隆/表達(dá))；細(xì)菌人工染色體(克隆/表達(dá))；酵母人工染色體(克隆/表達(dá))；Ti質(zhì)粒及其衍生載體(轉(zhuǎn)化)。第5頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(一)、目的基因的獲得基因工程最主要的特點(diǎn)是其定向性，也就是對特定的基因進(jìn)行操作。因此分離目的基因并獲得足夠的拷貝數(shù)(基因克隆)是基因工程及相關(guān)研究工作的前提。1.基因庫構(gòu)建與目的基因分離；2.PCR擴(kuò)增、克隆基因；3.基因合成(化學(xué)法、酶促法)。獲得目的基因后可進(jìn)行的研究還包括：序列分析、結(jié)構(gòu)分析、表達(dá)機(jī)制以及表達(dá)機(jī)制研究。第6頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三克隆的含義名詞(pl.clones)：克隆、無性(繁殖)系。生物個(gè)體、細(xì)胞的無性繁殖系；同一基因或DNA片段的多份拷貝。動詞(cloning)：克隆。細(xì)胞克隆：從單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生一組具有同樣遺傳組成的細(xì)胞；分子克?。韩@得單個(gè)基因/DNA片段多份拷貝。常用的方法有①將帶有目的片段的重組DNA分子導(dǎo)入到特定宿主細(xì)胞中，利用宿主細(xì)胞DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制；②利用DNA聚合酶在無細(xì)胞系統(tǒng)中復(fù)制(PCR,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。第7頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三基因庫構(gòu)建與目的基因分離基因庫(基因文庫)：包含特定基因組所有基因、DNA區(qū)段的全部分子克隆的集合體。根據(jù)分子克隆中所含核酸片段的類型，基因庫可分為：核基因庫、染色體庫、cDNA庫和線粒體庫等。構(gòu)建基因庫的基本過程以及從基因庫中篩選含目的基因克隆(亞克隆)的方法。第8頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(二)、轉(zhuǎn)基因受體受體的種類和特性對目的基因?qū)?、?dǎo)入后篩選、受體的再生等都有很大的影響。植物基因工程常用受體：組織、器官、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、未成熟胚、合子以及原生質(zhì)體等?？煞謩e通過器官發(fā)生、胚狀體或直接發(fā)育形成轉(zhuǎn)基因植株。動物基因工程受體主要有兩類：一是受精卵或早期胚胎，發(fā)育形成轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物獲得的性狀可以穩(wěn)定的遺傳，表明外源基因可以整合到受體的染色體上。另一類受體是體細(xì)胞無性系。第9頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(三)、目的基因?qū)胧荏w將目的基因?qū)胧荏w，并整合到受體染色體上是基因工程目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在基因工程研究領(lǐng)域的人們傾向于把所有將外源基因?qū)胧荏w的過程稱為轉(zhuǎn)化，將接受外源基因并整合到染色體上的細(xì)胞、個(gè)體稱為轉(zhuǎn)化體/轉(zhuǎn)化子。最常用轉(zhuǎn)化方法是：載體導(dǎo)入；理化方法導(dǎo)入(微注射、基因槍、電穿孔法、化學(xué)法)；還有一種特殊的方法是將外源總DNA導(dǎo)入植物。第10頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三1.載體法導(dǎo)入外源基因載體法——將目的基因連接到特定的載體(轉(zhuǎn)化載體)上，利用載體進(jìn)入細(xì)胞并整合到受體染色體上的能力實(shí)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)化。Ti質(zhì)粒及其衍生載體是最常用的植物基因工程轉(zhuǎn)化載體，具有導(dǎo)入外源基因并整合到染色體上的能力。將目的基因與載體連接的過程就是重組DNA分子構(gòu)建的過程。將含有轉(zhuǎn)化載體(重組DNA分子)的根癌農(nóng)桿菌與受體共培養(yǎng)就可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。第11頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三2.理化方法導(dǎo)入外源基因理化方法是采用物理、化學(xué)方法使受體細(xì)胞膜產(chǎn)生局部破損或缺陷，被動吸納外源DNA片段。(1)微注射/顯微注射。顯微鏡下用注射器將DNA片段注入受體細(xì)胞(動物受精卵)。?：0.5-10μm尖頭玻璃管。(2)基因槍。將DNA片段(載體)包在鎢或金微粒表面(?1-3μm)，用靜電或火藥爆炸等驅(qū)動微粒射入受體。(3)電穿孔法。將受體細(xì)胞置于脈沖電場中，可以使細(xì)胞膜產(chǎn)生短暫的(?30nm)左右的微孔，吸收DNA片段。(4)化學(xué)法。如PEG(聚乙二醇)可以刺激原生質(zhì)體產(chǎn)生吸收DNA片段。常用PEG與電穿孔法結(jié)合，提高外源DNA的吸收率。第12頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第13頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三*3.外源總DNA導(dǎo)入植物國內(nèi)生物科技工作者受基因工程在從分子水平進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的啟發(fā)，設(shè)計(jì)了一些外源DNA導(dǎo)入植物的方法。下述兩種方法均是采用供體植物的全部DNA提取物作為操作材料，省去了目的基因獲得的過程，所以稱為外源總DNA導(dǎo)入。減壓滲透法花粉管通道導(dǎo)入法第14頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三*(四)、轉(zhuǎn)化體的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化體篩選：根據(jù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)設(shè)計(jì)進(jìn)行，如：載體上帶有特異性狀標(biāo)記，特別是某種抗生素抗性等。轉(zhuǎn)化體鑒定有兩個(gè)層次：目的基因是否進(jìn)入受體(可以是大腸桿菌、酵母、植物或動物)，得到轉(zhuǎn)化體。

常用方法：限制性酶譜分析、核酸分子雜交、核酸序列測定、序列分析、RFLP等一切可鑒定特定DNA片段的方法。第15頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第16頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第17頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第18頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三基因工程的特點(diǎn)：從分子水平出發(fā)，以DNA為操作對象，直接對基因進(jìn)行操作?；蚬こ痰囊饬x：基因工程的成就與展望：原核生物真核生物轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因植物第19頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三*二、染色體工程染色體工程是物種間遺傳轉(zhuǎn)移的最傳統(tǒng)的方式，也是目前廣泛進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用的遺傳工程。利用染色體替換來改變生物遺傳特性，如利用染色體的易位、缺體、三體等方法，獲得新的染色體組合。其重要性因作物不同而異：對蕃茄而言，世界上任何具有商業(yè)價(jià)值的栽培品種都帶有一個(gè)從野生種導(dǎo)入的抗枯萎病性狀，其它六個(gè)野生種則是耐鹽性、抗蟲性等性狀的來源。小麥許多抗白粉病基因和抗銹病基因都來源于其野生近緣物種。相反，蠶蟲改良則完全是在栽培種內(nèi)進(jìn)行雜交選擇?，F(xiàn)在還不能從其它任何種導(dǎo)入基因到該作物中。第20頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(一)、種間有性雜交生殖隔離是物種形成的原因之一，也是染色體工程面臨的第一個(gè)難題，獲得種間有性雜種的難易直接影響外源基因?qū)朐耘嘧魑?。對不同的作物而言，種間雜交障礙的機(jī)制可能截然不同，其表現(xiàn)階段也各不相同。目前認(rèn)為，種間雜交產(chǎn)生雜種的障礙可能表現(xiàn)在以下幾個(gè)階段：受精前柱頭和花柱中的障礙；受精過程中的障礙；受精后胚與種子發(fā)育過程中的障礙。第21頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三受精前障礙與克服障礙機(jī)制：物種間花粉管與雌蕊不親和，在花粉管到達(dá)胚珠之前，停止伸長而不能受精。主要克服辦法：主要是選擇適當(dāng)?shù)氖诜蹠r(shí)期，采用正反雜交、蒙導(dǎo)授粉、植物生長調(diào)節(jié)劑等。另外，有明確試驗(yàn)證據(jù)表明，栽培物種和野生種內(nèi)均存在可雜交性遺傳變異，并受簡單遺傳控制。利用可雜交性基因，能提高種間雜交的效率。第22頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三受精過程的障礙與克服被子植物受精過程屬于雙受精，對種間雜交受精過程的生殖生物學(xué)研究表明：種間雜交的失敗往往是由于雙受精之一失敗引起的。訖今為止，人們對受精的控制機(jī)制知之甚少，所以這一領(lǐng)域明顯是一個(gè)有風(fēng)險(xiǎn)，但又極可能富有成效的研究領(lǐng)域。第23頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三受精后發(fā)育障礙與克服受精過程的障礙機(jī)制：受精胚珠發(fā)育過程中也經(jīng)常由于胚、胚乳和母本組織發(fā)育異?；虬l(fā)育不平衡而最終不能產(chǎn)生種間雜種種子。克服方法：常用技術(shù)是從生理角度進(jìn)行調(diào)節(jié)，如：采用植物生長調(diào)節(jié)劑或去除母本植株的營養(yǎng)生長中心。提高親本倍性水平，可能有利于胚珠發(fā)育。通過離體培養(yǎng)方法可以挽救可能(即將)敗育的雜種胚。第24頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(二)、雙二倍體的合成獲得種間雜種不一定就能在物種間進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)移。物種間的不親和性不僅表現(xiàn)在受精前、受精及受精后各過程中；親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間雜種往往存在不同程度不育性；因而難以進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。事實(shí)上許多種間雜交試驗(yàn)都僅限于獲得雜種F1。加倍雜種染色體數(shù)目，雙二倍體中親本染色體均成對存在，可能產(chǎn)生可育配子；穩(wěn)定雙二倍體可作為新物種直接用于生產(chǎn)。但由于合成雙二倍體往往常有野生種的不利性狀，農(nóng)藝價(jià)值降低。第25頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(三)、削減、添加、代換、易位絕大多數(shù)雙二倍體遺傳不穩(wěn)定，在種間雜種及其雙二倍體基礎(chǔ)上，人們設(shè)計(jì)了許多染色體操作方案，以導(dǎo)入外源目的基因，并盡可能避免導(dǎo)入對受體有害的遺傳物質(zhì)。理想的情況是只摻入目的基因，而排除外源物種的其它基因。由于遺傳重組可能性有限，所以導(dǎo)入整條染色體(異附加系、異代換系)是利用外源基因的一種重要方式。外源染色體上連鎖的不利基因往往極大地限制附加系和異代換系的利用價(jià)值，因而可以采用：輻射、遺傳、單體附加等方式誘導(dǎo)外源染色體與栽培物種染色體易位。第26頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(四)、染色體工程中的現(xiàn)代技術(shù)在傳統(tǒng)遠(yuǎn)緣雜交的基礎(chǔ)上采用的現(xiàn)代技術(shù)主要是：離體胚(子房)培養(yǎng)技術(shù)；植物染色體顯帶技術(shù)；染色體分子原位雜交技術(shù)等。染色體工程仍然是外源基因轉(zhuǎn)移最有效、最接近實(shí)際應(yīng)用的技術(shù)。第27頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三*三、細(xì)胞工程利用細(xì)胞的全能性，采用組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對動、植物進(jìn)行修飾，為人類提供優(yōu)良品種、產(chǎn)品和保存珍貴物種。主要包括體細(xì)胞融合，核移植，細(xì)胞器攝取和染色體片段的重組等。細(xì)胞工程主要技術(shù)和研究領(lǐng)域包括：細(xì)胞、原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)；細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生；體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)、篩選與應(yīng)用；以細(xì)胞、原生質(zhì)體作為基因工程受體；細(xì)胞、原生質(zhì)體融合、雜種細(xì)胞篩選、鑒定與應(yīng)用。第28頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(一)、細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生采用體細(xì)胞雜交在物種間進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)移與應(yīng)用的必要條件是：細(xì)胞、原生質(zhì)體遺傳全能性能充分實(shí)現(xiàn)，再生成新的生物個(gè)體。植物：細(xì)胞和原生質(zhì)體再生技術(shù)已經(jīng)比較成熟。曾經(jīng)是人們公認(rèn)難題的禾本科植物原生質(zhì)體再生在近二十多年來也已取得巨大進(jìn)展。動物：“多利”的誕生表明，動物細(xì)胞(包括人體細(xì)胞)再生成為個(gè)體都是可能，其技術(shù)實(shí)現(xiàn)需要的僅僅是時(shí)間。第29頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(二)、植物原生質(zhì)體作為基因工程的受體最初常用的轉(zhuǎn)基因受體有葉圓片、幼胚、愈傷組織等植物組織器官。在這些組織、器官中：細(xì)胞壁的存在會增加操作的難度；產(chǎn)生細(xì)胞嵌合體現(xiàn)象，難以篩選轉(zhuǎn)化子。因此原生質(zhì)體是最具潛力的植物基因工程受體，轉(zhuǎn)化效率高、篩選方便。第30頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三(三)、細(xì)胞、原生質(zhì)體融合體細(xì)胞融合是指兩個(gè)不同種類的細(xì)胞，加上融合劑，在一定條件下，彼此融合成雜交細(xì)胞，使來自兩個(gè)親本細(xì)胞的基因有可能都被表達(dá)，這就打破了遠(yuǎn)緣生物不能雜交的屏障，提供了創(chuàng)造新物種的可能。動物細(xì)胞不具有細(xì)胞壁，細(xì)胞融合技術(shù)較植物成熟和成功，但局限于獲得雜種細(xì)胞及其無性細(xì)胞系。

用雜種細(xì)胞核代替維爾·穆特獲得克隆羊所采用的乳腺細(xì)胞核可以獲得物種間雜種生物個(gè)體。如今已在動物間實(shí)現(xiàn)了小鼠和田鼠，小鼠和小雞