糖苷酶及其抑制劑的知識(shí)

糖苷酶及其抑制劑的研究摘要：糖苷酶是生命體正常運(yùn)轉(zhuǎn)的關(guān)鍵性酶，糖苷酶抑制劑可抑制糖苷酶的活性，阻斷碳水化合物的分解，因此對(duì)一些糖代謝紊亂性疾病如糖尿病、肥胖病等有臨床應(yīng)用價(jià)值。本文研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶以及蔗糖酶的抑制劑。重點(diǎn)研究了β－半乳糖苷酶的分子結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)，并從結(jié)構(gòu)出發(fā)篩選其抑制劑，發(fā)現(xiàn)此酶的抑制劑種類較少且抑制活性較低。本實(shí)驗(yàn)采用混合交叉篩選法篩選了多種金屬離子和氨基酸對(duì)β－半乳糖苷酶的抑制作用，同時(shí)也篩選了天然產(chǎn)物和合成化合物。關(guān)鍵詞：糖苷酶β－半乳糖苷酶β－葡萄糖苷酶蔗糖酶抑制劑的篩選混合交叉法1、前言糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶不僅參與了體內(nèi)碳水化合物的消化，而且是糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖鏈的修剪酶，它對(duì)糖蛋白中寡糖鏈的形成極為重要；糖鏈的組成與結(jié)構(gòu)是糖蛋白特異生物功能的識(shí)別部位，因此糖苷酶活性對(duì)糖蛋白生物合成有關(guān)鍵作用，而后者又涉及到免疫反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞的分化、腫瘤的轉(zhuǎn)移以及病毒和細(xì)菌的感染.因此,糖苷酶不僅是生命體正常運(yùn)轉(zhuǎn)的關(guān)鍵性酶,同時(shí)又是許多疾病的相關(guān)酶.與病毒感染、癌癥及一系列新陳代謝紊亂性疾病如糖尿病、肥胖病有關(guān)。由于糖苷酶重要的生物學(xué)意義，糖苷酶抑制劑的研究也引起了人們的極大興趣。糖苷酶抑制劑即是可抑制糖苷酶的活性，阻斷碳水化合物的分解，抑制淀粉、麥芽糖、蔗糖轉(zhuǎn)變成單糖；影響糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖鏈的修剪；所以糖苷酶抑制劑不但對(duì)一些糖代謝紊亂性疾病如糖尿病、肥胖病等有臨床應(yīng)用價(jià)值[1]，而且可作為抗AIDS病毒[2]、抗鼠白血病毒[3]的潛在治療試劑。本論文重點(diǎn)研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）又稱β－D－半乳糖苷水解酶，（β－D－galactosid--egalacto-hydrolase,EC..23）,商品名為乳糖酶（Lactase），它廣泛存在于豆類及其他各種動(dòng)植物體內(nèi)和微生物中。它能夠催化β－半乳糖苷化合物中的β－半乳糖苷鍵發(fā)生水解，還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷鍵結(jié)構(gòu)特異性，可作為乳糖降解和雙糖合成催化劑[4,5]，并有水解生物體內(nèi)儲(chǔ)存的多糖和半乳糖殘基.引起血型轉(zhuǎn)化等生理功能[6,7]而受到人們廣泛關(guān)注，成為生物化學(xué)和酶催化化學(xué)的重要研究課題。β－半乳糖苷酶的應(yīng)用有著長(zhǎng)遠(yuǎn)的歷史，最初在食品工業(yè)中用來降解乳糖含量以滿足乳糖不適癥患者的需要，然而隨著生物技術(shù)的發(fā)展，它越來越應(yīng)用于基因工程、蛋白質(zhì)工程和疾病診斷方面。將β-半乳糖苷酶與人體胞外淀粉狀蛋白前體融合形成融合蛋白,可作為Alzheimer病的免疫源,并進(jìn)一步制備其單克隆抗體[8]。還有報(bào)道將β-半乳糖苷酶作為一種輔蛋白,用作貓白血病毒gp70的疫苗[9]。在診斷方面,將抗菌性HIV病毒基因與β-半乳糖苷酶基因LacZ重組后作為定量HIV利用循環(huán)的早期抑制作用,并預(yù)測(cè)化合物抗HIV的活性工具。同時(shí)，近年來β－半乳糖苷酶基因被越來越頻繁的用于轉(zhuǎn)基因治療方面，β－半乳糖苷酶基因作為報(bào)告基因，通過檢測(cè)β－半乳糖苷酶的表達(dá)情況，研究轉(zhuǎn)基因治療[10]。在環(huán)境檢測(cè)方面,大腸桿菌的β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)可快速分析浴場(chǎng)和漁場(chǎng)地區(qū)水體受排泄物污染程度。盜由于趣β宿－半乳糖苷再酶的廣泛應(yīng)哈用和重要的叉臨床價(jià)值，撲人們對(duì)此酶膊的基因進(jìn)行夏了深入的研聯(lián)究，通過眾圓多學(xué)者的努翅力，目前續(xù)β斜－半乳糖苷仙酶基因庫已夏基本建立并袖將日趨完善準(zhǔn)。但是，對(duì)辨于此酶的抑顛制劑研究還糟很少，吳目前文獻(xiàn)中溉所報(bào)道的研奪究酶和抑制愛劑相互作用房的方法，基返本上是用單肚一的競(jìng)爭(zhēng)性咬或非競(jìng)爭(zhēng)性比抑制劑與酶緒作用，通過綢動(dòng)力學(xué)研究顫或用現(xiàn)代儀予器分析技術(shù)伍進(jìn)行表征，屠獲得有關(guān)胞酶的結(jié)構(gòu)或艷催化機(jī)制的蒸信息。本實(shí)里驗(yàn)就從酶的伯結(jié)構(gòu)出發(fā)，濃探討研究并店大量篩選其留抑制劑。鎖Overa卻llvi艦ewso浮fthe紡撓β-gal酸actos咽idase拒acti勇vesi役te擋Figur壺e1.昌Ster逃eovie腥wof采asur貸face辣repre足senta買tion娃ofth城etet戴ramer乓inw淺hich尿each經(jīng)subun袖it約issh造owni幫nad原iffer卡entc錦olor.某Two擊lacto堤semo著lecul斑es(s例hown鑄inwh均it畢e)ar北esho帽wnbi串nding擾int康heac央tive怖site翅pocke羨ts.T辦hede苗epest低part詠sof勁帽thea系ctive彼site糠sare直not改visib應(yīng)lein趟the謹(jǐn)figur勤e.Th敗eoth謊ertw鉤oact展ives補(bǔ)ites飽areo互nthe復(fù)“bac抄k”si送deof豬the隸tetra貨mer.絲F鍛i揭gure2曬.予Close墻rste瓦reovi寄ewof氧asi妙ngle驅(qū)activ肯esit捆e.Pr上otein脖atom盈sare規(guī)colo欄redb每y巨d糧omain廊with菌doma盤in冒1in曬blue高,dom虛ain慶2in耗另cyan,食doma裝in邀3in殖yell燒ow,a哈nddo晉main差5in哭r(nóng)ed憐(ther折eare毀noa牌toms伙from壩domai榨n4).要Solv土entm睡olecu廁lesa丹ndme領(lǐng)tals爺arei律nwhi嫁te.T都heye帳llow衣桃balls怨are按metal額liga段ndsw托hich是arep素rotei矩nato殃ms.T獵hese駕mitra宵nspar狹e繳nt她s閘urfac站ewas徹calc默ulate浴dusi關(guān)ngpr嗎otein嶼atom吃splu以ssol進(jìn)vent雕atoms飽with皆利B爬<截25?2呈.Two日liga根ndsa筆resh值own:逆lacto田se(g邪reen)雹bind立sin缺the“肉shall馬ow”m爐odew體hile眼gala統(tǒng)ctono薄-lac仿tone震血(red)隸bind倘sin務(wù)the“幻deepe索r”mo專de.揚(yáng)通過對(duì)酶的城分粒子結(jié)構(gòu)和活揀性基團(tuán)的分魯析，發(fā)現(xiàn)其遲蛋白質(zhì)原子夢(mèng)中有金屬配落體，因此研艘究了金屬離拋?zhàn)雍桶被岬V對(duì)此酶的抑前制活性。拍2.實(shí)驗(yàn)部肉分算1、混合交皂叉法篩選金示屬離子和氨奮基酸等生物乳小分子恒Table欲1.The冤coop孟erati瞞onef朝fect防ofAm畏inoa炎cids椅andM嗽etals席Mixtu上reof叉Amin松oacid鎮(zhèn)s渡Relat沉ivea喬ctivi墨ty(%)聽Mixtu暫reof多M獻(xiàn)etals粥Ala也88.5怒88.9主Co產(chǎn)Cys勾87.6犬96.7遙Ni使Ser磚90.4母95.7版B特Lys丈92.1致98.3罩Cd肝Phe披101繡92.1蹲Zn課His增100泄92.6劈Mn膜Leu紗97.8命92.1賴Cu延Trp侮98.1尼87.3替Mg燭從上表可以組看出，金屬查離子和氨基次酸有協(xié)同抑碗制活性，但氧抑制效果較我小，當(dāng)單獨(dú)決的金屬離子降有激活作用楚時(shí)（如Mg渾），協(xié)同多重種氨基酸反手而表現(xiàn)有抑探制活性，可乖以初步判斷笑比較好的是塔Co和Al醉a的協(xié)同效照果。枝2、天然產(chǎn)躁物化合物的泰篩選貍包括黃酮類鄰、異黃酮猴類、染料關(guān)木素及其銅豐、鋅、硼絡(luò)碰合物、酰執(zhí)化物、多酚枝類、聯(lián)苯才類等一系列謝化合物。勁Table梳2.Th醋eThe洋inhi固bitio鐘nof感natur落ecom鳥pound單位：mM弱Compo踐und植IC50恨和厚樸酚電4.73上厚樸酚膀－餐染料木素算－壤茶多酚根4.96盟槲皮素溜－逢小檗堿支－題黃芩苷絨－泡半乳糖珠17.4洗曲克盧丁貸－慈銅絡(luò)合Ge真niste噴in乘－鑒鋅絡(luò)合Ge朵niste桃in剝－仰改造厚樸酚貓－虎改造和厚樸愚酚腎－脖3、合成化振合物的篩選倆通過篩選發(fā)晃現(xiàn)，奎啉類茂衍生物對(duì)礙β嗎－半乳糖苷蚊酶具有一定竿的抑制活性刊。圍Table序3.Th綠einh記ibiti舉onof宣synt任hesis馬comp警ounds單位：mM熔Compo哲und抖IC50認(rèn)1.72踐0.332郊0.032皂9也3.結(jié)果與懲討論蟻通過上述多顆種金屬離子循、氨基酸徑以及天然產(chǎn)淹物和合成化映合物的大量電篩選，我們最得出一定的逐酶與抑制劑崇的構(gòu)效關(guān)系駁討論：盆1落、二環(huán)或鉆三環(huán)多酚類姑化合物對(duì)該兵酶有抑制效醉果滴2秤、三環(huán)類飲黃酮化合物抬的桐C勒環(huán)若為剛性干的苯環(huán)則沒餐有抑制效果麻。跳3晚、喹啉衍我生物中取代頓基中含有較欣大原子的化拉合物抑制效殲果更好疤4雪、喹啉衍省生物中取代己基含有氨基何支鏈的抑制憂效果較好工在研究衫β豆－半乳糖苷尖酶的同時(shí)也問研究了糖苷攏酶中的爸β腳－葡萄糖苷披酶和儲(chǔ)α狂－蔗糖酶，說對(duì)它們的抑禿制劑也進(jìn)行取了篩選，發(fā)膏現(xiàn)下面三種召化合物同時(shí)粱對(duì)正β餅－半乳糖苷哲酶、蔥β橫－葡萄糖苷托酶有抑制活陪性。糊對(duì)三種糖苷北酶抑制劑的煮篩選我們得袍出以下結(jié)論卻：倉(cāng)1.飾β?lián)P－半乳糖苷內(nèi)酶、襖β績(jī)－葡萄糖苷密酶、賠α率－蔗糖酶的嗓潛在抑制劑層的高效抑制找較少且抑制鋤活性較低