瓊脂糖凝膠電泳詳細(xì)過(guò)程與步驟演示文稿

瓊脂糖凝膠電泳詳細(xì)過(guò)程與步驟演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳詳細(xì)過(guò)程與步驟目前二頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)

天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉是從石花菜及其它紅藻類植物提取出來(lái)的一種線狀高聚物。

瓊脂糖（agarose）半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷D-半乳糖目前三頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲2.對(duì)蛋白質(zhì)吸附極微，故無(wú)拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來(lái)分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測(cè)定6.樣品易回收，常用于制備。瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)目前四頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)缺點(diǎn)1.機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。4.與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。目前五頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳分離DNA的原理和方法DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定。目前六頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。溴化乙錠（EthidiumBromide,

EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。目前七頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品質(zhì)粒DNA樣品。電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測(cè)儀等。瓊脂糖，1XTBE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液四、實(shí)驗(yàn)步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）目前八頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約30min-60min。目前九頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。目前十頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十一頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十二頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十三頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十四頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十五頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十六頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十七頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十八頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)123M目前十九頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)1、DNA分子的大小

雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)近似成反比；

2、瓊脂糖濃度

濃度越低，相同核酸分子遷移越快；

3、DNA的構(gòu)象

同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀DNA的遷移速率決定因素目前二十頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)4、凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠

溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長(zhǎng)度增加。5、所用的電壓

低電壓時(shí)DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。6、瓊脂糖種類

常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖；目前二十一頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)

不同類型瓊脂糖的性質(zhì)

瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/℃

標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35~3890~95不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40~4285~90

高強(qiáng)度瓊脂糖34~4385~95

修飾的低熔點(diǎn)/凝點(diǎn)瓊脂糖25~3563~653565

超低熔點(diǎn)8~1540~45

低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖25~307038853075目前二十二頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃度（%）標(biāo)準(zhǔn)(kb)高強(qiáng)度(kb)低熔點(diǎn)(kb)低黏度低溶點(diǎn)(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.1目前二十三頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)常用的電泳緩沖液4℃保存?zhèn)溆?7、電泳緩沖液目前二十四頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)TAE和TBE電泳緩沖液比較都是常用電泳緩沖液，二者相比：1）TAE的緩沖容量較低，如長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)被消耗，此時(shí)凝膠的陽(yáng)極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE比TAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE中遷移快10%；4）對(duì)于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，對(duì)于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。目前二十五頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個(gè)作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過(guò)程；3）其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。目前二十六頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)6×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯氰15%聚蔗糖(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)4℃40%(m/V)蔗糖水溶液目前二十七頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)瓊脂糖凝膠中DNA的檢測(cè)

通過(guò)染色,紫外燈下檢測(cè)。主要采用溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法。目前二十八頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前二十九頁(yè)\總數(shù)三十一頁(yè)\編于十七點(diǎn)使用EB染色注意事項(xiàng)（1）EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)（2）EB可用來(lái)檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸（3）EB使用時(shí)的配制、貯存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫