常用固定液的性質(zhì)、用途

常用固定液的性質(zhì)、用途和配置單一固定液的性質(zhì)和用途乙醇(C2H5OH)(ethylalcohol):又名酒精，可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，后者易溶于水，所以經(jīng)酒精固定的標本對細胞核染色不良。酒精可溶解脂肪、類脂體，所以不能用酒精固定脂肪。酒精可沉淀肝糖，但仍可溶解于水，因此肝糖經(jīng)酒精固定后不能在低于70%酒精中保存。單獨固定使用酒精的濃度應為95—100%。無水酒精滲透力較差，并且能使組織收縮，在與醋酸、氯仿混合使用時，可增強它們的穿透力。酒精除固定作用外，還具有硬化和脫水的作用，固定后的組織可保存于70%酒精中，所以酒精在制片過程中用途很大。無水乙醇容易揮發(fā)，又容易吸收空氣中的水分，所以瓶蓋必須塞緊，為了吸去其中水分，最好在無水乙醇瓶內(nèi)放入少量無水硫酸銅粉末。酒精是一種還原劑，不能與重鉻酸鉀、鋨酸等氧化劑混合使用。甲醛(HCHO)(formeldehyde)：是一種氣體，溶于水成為甲醛水溶液或稱福爾馬林，一般使用濃度為10%福爾馬林(formalin)液，其配法是取市售的甲醛液10ml與90ml蒸餾水混合即可，實際上其含量只有4%甲醛。這樣的配法已成為一般實驗室常用的慣例。甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白，但能與蛋白質(zhì)化合。它是一種應用廣泛，使用簡單的固定液，具有穿透力強、固定均勻、組織收縮小、硬度適當，適用于一般器官組織的固定及保存。尤其對脂肪、神經(jīng)組織固定效果較好。更適于病理組織的制片及大體積標本的保存，一般組織需固定24小時以上，固定后的組織可移入50%酒精中逐步脫水。甲醛是一種強還原劑，不能與鉻酸、重鉻酸鉀、鋨酸等氧化劑混合，因極易被氧化為甲酸。在配混合固定液時，如海利氏液等需臨用前再加入，24小時后失效。甲醛由于長期貯存，特別是低溫氣候，容易產(chǎn)生多聚甲醛，即溶液中的白色沉淀，在高溫下又成為甲醛。不純的甲醛易產(chǎn)生甲酸，使溶液變?yōu)樗嵝?，影響核的染色。所以在備用的福爾馬林中加入小量的醋酸鈣、碳酸鎂或大理石作為中和劑?？捎孟路ㄅ渲?0%中性甲醛溶液，pH為7.0左右：40%甲醛100ml蒸餾水900ml磷酸二氫鈉(NaH2PO4?H2O)4.0g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)6.5g甲醛醋酸鈣溶液：40%甲醛10ml醋酸鈣2g蒸餾水加至100ml.醋酸(CH3COOH)(aceticacid)純醋酸在低溫時結成冰狀故又名冰醋酸，約在17°C時融化，能和水及乙醇混合。使用濃度為0.3—5%，它能很好地沉淀核蛋白，對染色質(zhì)的固定效果很好。醋酸對染色體的保存能接近生活狀態(tài)，因此在固定染色體的固定液中幾乎都含醋酸。醋酸的穿透力很強。它能使組織膨脹，常與其他藥劑配合使用，起抑制其他固定劑對組織收縮的作用。醋酸破壞線粒體和高爾基體，所以在線粒體和高爾基體制片及固定液中都不用醋酸。(4)苦味酸(C6H2(NO2)3OH)(picricacid):是一種強酸，呈黃色結晶，溶于水、乙醇、苯和二甲苯。干燥時能自燃，爆炸，所以需濕性保存。一般配成飽和水溶液備用(100ml蒸餾水加1.2g苦味酸)?？辔端崮艹恋淼鞍踪|(zhì)，對胞質(zhì)固定較好?？辔端岬拇┩噶苈苁菇M織強烈收縮，一般都與醋酸等藥劑配合使用?？辔端峁潭ǖ慕M織會出現(xiàn)黃色，可在低度酒精中加入少量碳酸鋰飽和水溶液，洗去黃色。如遺留少許黃色在組織中，對染色無影響。重鉻酸鉀(K2CrO7)(potassiumdichromate):呈橙紅色結晶，可溶于水，有毒，是強氧化劑，不應和乙醇混合。它穿透力強，能使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄?，能保持細胞質(zhì)的結構與生活狀態(tài)相仿，并用于線粒體和高爾基復合器的固定，但需與甲醛、氯化汞等混合使用，是細胞學良好的固定劑。重鉻酸鉀固定的組織需經(jīng)流水沖洗12—24小時。鉻酸(H2CrO4)(chromicacid):為強氧化劑，是一種弱酸，呈紅色或淺褐色結晶，極易潮解，所以最好配成1%的水溶液保存。它是強烈的沉淀劑，不單獨使用。硬化程度中等。固定肝糖的效果優(yōu)良，它使肝糖不溶于水。在固定線粒體和高爾基復合器的固定液中都含有鉻酸成分。鉻酸穿透力較慢，不使組織收縮。固定后的組織需經(jīng)流水沖洗12小時以上，洗去鉻酸，否則會發(fā)生沉淀，影響染色。氯化汞(HgCl2) (mercurybichloride):又稱升汞，呈白色針狀結晶，能升華，是一種極毒的藥品，對粘膜有腐蝕作用，使用時需特別當心。氯化汞能沉淀一切蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)變性不溶于水，對一般染色效果很好，對固定線粒體和高爾基體的效果也很好。氯化汞穿透力較弱，收縮力較大，所以一般與醋酸、甲醛等混合使用。經(jīng)氯化汞固定的組織會產(chǎn)生氯化亞汞沉淀，所以組織或切片需用0.5%碘酒處理3—5分鐘，除去沉淀物，然后用2%硫代硫酸鈉水溶液去碘處理1—2分鐘。四氧化鋨(OsO4)(osmiulntatroxide):又名鋨酸(osmicacid)。是一種淡黃色結晶體，為強氧化劑，不可與酒精、甲醛混合，在配制使用過程中瓶皿需特別潔凈，固定濃度為1—2%水溶液。需用棕色瓶貯存于4°C冰箱內(nèi)。鋨酸是固定脂肪的最好固定劑。穿透速度很慢，能均勻固定蛋白質(zhì)，能保持細胞生活時形態(tài)，不引起細胞收縮，對細胞質(zhì)的保存較好，特別適用于線粒體、高爾基復合器的固定。固定后的透明處理，用苯為透明劑可得良好的切片效果。鋨酸價格極貴，毒性高，蒸氣易損傷眼睛及粘膜，使用時應加小心。鋨酸固定的組織切片，不易被蘇木精著色，需經(jīng)過漂白處理。Lacour漂白液的配制：20%H2O210ml80%酒精30ml將切片置此液中漂白4—12小時，移入80%酒精、70%酒精、50%酒精中各2分鐘，蒸餾水充分洗滌后，再進行染色。以上簡單的固定液各有優(yōu)缺點，如無水酒精可固定肝糖，但不能固定脂肪，因脂肪易溶于酒精。而鋨酸能固定脂肪，氯化汞對蛋白質(zhì)固定較好，冰醋酸可以固定核蛋白等，它們只是對細胞的某些成分固定較好，而不能將所有成分都保存下來。如果互相配合使用，則能取長補短，得到較好的固定效果，只有了解藥品的性質(zhì)，才能清楚各固定液的性能。下面介紹幾種常用的混合固定劑。混合固定液的配制和性能包音氏(Bouin’s)固定液)苦味酸飽和水溶液75ml甲醛(40%)25ml冰醋酸5ml本液在使用前配制。包音氏液為常用的良好固定劑，適用于無脊椎動物，組織學、胚胎學均可應用。滲透力迅速，固定均勻，組織收縮少。小塊組織固定2—12小時，一般組織固定12—24小時，固定后用50%酒精洗滌數(shù)次。此液固定的組織適于蘇木精、伊紅等染色。用馬瑞氏三色染色，能得艷麗的圖像。任克氏(Zenker's)固定液)重鉻酸鉀2.5g氯化汞6g蒸餾水100ml冰醋酸5ml配制時將重鉻酸鉀、氯化汞溶于加溫的蒸餾水，冰醋酸臨用前加入。此固定液適用于細胞學、組織學的研究工作。固定時間一般需12—24小時。固定后要用流水沖洗12小時，用碘去汞。此液固定的組織適于一般染色，細胞核、細胞質(zhì)染色較為清晰。（3）海利氏（Helly's）液重鉻酸鉀2.5g氯化汞6g蒸餾水100ml40%甲醛液5ml此固定液是將任克氏配方中的冰醋酸換成甲醛液，甲醛也在用前加入，因在加入甲醛24小時后即生成沉淀而失效。固定時間12—24小時。海利氏液為骨髓、脾、肝等造血器官的較好固定劑。此液亦可保存線粒體，染色前需用碘去汞。（4）蘇薩氏（Susa's）［海登哈音氏（Heidenhain's）］液：氯化汞4.5g氯化鈉0.5g40%甲醛液20ml三氯醋酸2g冰醋酸4ml蒸餾水80ml將4.5g氯化汞和0.5g氯化鈉溶于80ml蒸餾水中保存。臨用前取此液20ml，加入三氯醋酸0.5g，40%甲醛5ml，冰醋酸1ml，混合使用。此液含有三氯醋酸和氯化鈉，對較硬的組織有軟化作用，如皮膚、蛔蟲卵、昆蟲幼蟲等角質(zhì)層較厚的組織，食道、胃均能適用。它具有滲透快、收縮小的優(yōu)點。小塊組織固定3—5小時；大塊組織，如皮膚固定12—24小時。固定后可直接入95%酒精洗滌，勿入水或低度酒精，否則易使膠原纖維膨脹。切片在染色前，用碘去汞。（5）卡諾氏（Carnoy's）液純酒精60ml氯仿30ml冰醋酸10ml此液穿透力強，對核固定優(yōu)良，是細胞學制片常用的固定液。酒精能固定胞漿及沉淀肝糖，冰醋酸能固定染色質(zhì)并防止酒精過度硬化和收縮，氯仿可增加滲透力。小白鼠的睪丸和馬蛔蟲的子宮固定需30—50分鐘，稍大一些的淋巴結、胸腺等組織，可固定1—2小時。時間太長易使組織過度硬化，不利于切片。固定后直接入95%酒精洗滌，然后脫水、透明、包埋。（6）酒精、甲醛（簡稱A.F）液95%酒精90ml40%甲醛10ml如需要可加入0.5g的醋酸鈣使其呈中性。此液有固定兼脫水的作用，用于病理快速診斷的制片，也適于肥大細胞的固定。2—3mm厚的病理組織在50°C固定40分鐘，一般室溫固定12—20小時，固定后可直接入95%酒精脫水?？傊?，固定液的種類很多，用時可查閱制片方面的書籍。首先要根據(jù)實驗目的，選用固定液。但應用時必須首先了解各種混合固定液中的組成成分能否預先混合，固定后是否需要洗滌，然后再開始配制固定液。固定液和保存液用固定液固定動植物整體或它的一部分組織和氣管等，能保存組織內(nèi)細胞的形態(tài)、結構及其組成，盡量使它近于生活狀態(tài)。固定液一般有防腐和保存的作用，分為單純固定液和混合固定液。單純固定液中最重要的有乙醇、福爾馬林、醋酸、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、升汞等，前兩種固定液是中學生物實驗室常用的。單純固定液的優(yōu)點是簡便，缺點是有一定的局限性，不易達到理想的固定要求?；旌瞎潭ㄒ河袔追N不同的藥液按一定的比例混合而成，使各自的優(yōu)缺點相互補充，成為較完美的固定液。這種固定液的制備雖比較麻煩，但是效果比較好。常用的混合固定液是醋酸-酒精混合液、福爾馬林-醋酸-酒精液、包因氏固定液等。常用的保存液大致跟固定液相同，主要是福爾馬林、酒精、甘油以及由這些藥物按比例配制成的各種混合液。有時按特殊保存的需要，再保存液中增加某些藥品(如原生標本的保存液)。1、 福爾馬林福爾馬林在固定組織標本時殺菌能力強，所以防腐性強，滲透力大，固定得快。永福爾馬林固定精細的解剖標本時，要跟甘油、酒精、石炭酸等混合使用。固定液常用的濃度是5?10%(根據(jù)材料的大小、性質(zhì)和數(shù)量而定)。保存液常用的濃度是5?10%。用福爾馬林作保存液，效果好且價格低廉。在配制福爾馬林溶液(固定液或保存液)時，應將37?40%的甲醛作為整個溶質(zhì)來配。例如配制5%福爾馬林是取市售37?40%甲醛溶液5毫升跟95毫升蒸餾水混合。實際上甲醛含量只有1.9?2%，這樣的配法已成為一般實驗室常用的慣例。注意事項：福爾馬林業(yè)在長期貯存中會產(chǎn)生蟻酸，可適量的加入碳酸鈣或碳酸鎂等堿性物質(zhì)進行中和。福爾馬林業(yè)作為保存液會慢慢揮發(fā)而致使?jié)舛冉档?，并且福爾馬林液再保存中往往形成多聚甲醛，使浸液變濁，影響觀察。所以，根據(jù)一定保存期的情況，可適當增加福爾馬林液的濃度或更換新液，以防標本變壞。其中如有白色沉淀物，加熱后可使它溶解。市售的福爾馬林液常帶有酸性，能腐蝕石灰質(zhì)，因此，最好不用福爾馬林液浸制有石灰質(zhì)外殼的動物。2、 酒精(乙醇)酒精也是常用的固定液，它有強烈的殺菌作用，對組織材料的滲透力較大，固定的快。但是，它的脫水作用較強，在高濃度的酒精中容易使材料顯著硬化和收縮。一般用于固定浸制標本材料，分一級或二級固定，即70%或50%與70%的酒精。有些小型材料或精細的解剖材料，最好用二級或三級固定，即用50%、70%或50%、60%、70%的酒精，最后再進行保存。從經(jīng)濟效果來考慮，一般酒精應跟福爾馬林液等固定液混合使用。市售的工業(yè)用酒精濃度是95%左右，因此用時要重新配制。保存液的濃度通常是70%。注意事項：(1)在固定材料時要注意固定的效果，小型材料一般放在固定液中固定。大型材料必須先往體內(nèi)注射一部分固定液，再放入固定液中，防止材料內(nèi)部腐懷變質(zhì)。用福爾馬林液固定也是如此。（2） 高濃度的酒精有脫水、脫脂作用。含有多量脂肪或擬脂標本（如腦、脊髓）等都不宜用較高濃度的酒精作保存液。（3） 為了防止酒精使標本硬化，保存一些精細的材料或解剖標本時，因加入少量甘油，因為甘油具有潤軟組織的作用。（4） 忌跟鉻酸、鋨酸和中鉻酸鉀等氧化劑配合。3、 醋酸醋酸即乙酸，純醋酸在低于16.7攝氏度時會凝成冰狀固體，所以叫冰醋酸。醋酸能很快穿透組織，因為它不能沉淀細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，組織不會硬化。一般常跟酒精、福爾馬林、鉻酸等容易引起組織變硬和收縮的液體混合，以起到相互抵消的作用。醋酸固定液的常用濃度是0.3%?5%。4、 苦味酸苦味酸是一種黃色結晶，能溶于水（溶解度是0.9?1.2%）、酒精（溶解度是4.9%）和苯（溶解度是10%）。苦味酸也能沉淀一切蛋白質(zhì)，穿透較慢，固定后，組織收縮明顯，但不使組織硬化?？辔端峁潭ㄒ嚎梢栽?00毫升蒸餾水中加入苦味酸約1.5克，制成飽和水溶液。固體苦味酸易爆，長制成飽和水溶液保存。5、 升汞升汞又叫氯化汞，是白色粉末，以針狀結晶為最純。通常固定時用飽和水溶液，有時也用70%酒精作溶劑，不單獨用作固定劑。升汞的穿透力較弱，通常用于小型材料，對蛋白質(zhì)有強烈的沉淀作用，硬化程度中等。固定液用飽和溶液，濃度約為7%。6、 卡爾氏（Carl's）液配方95%酒精170毫升蒸餾水280毫升福爾馬林60毫升冰醋酸20毫升冰醋酸要在臨用前加入。這時極好的昆蟲保存液，常用來殺死和保存小型、身體柔軟的種類入螨、螟蚣、馬陸等。在這溶液里加入少量甘油，能防止蟲體變脆。7、 卡諾氏（Carnoy's）液配方純酒精6份冰醋酸1份氯仿3份這種固定液能固定細胞質(zhì)和細胞核，尤其適宜于固定染色體，所以多用于細胞學的質(zhì)片，還用來固定腺體、淋巴組織以及原生動物的胞殼等。這種固定液穿透得快，因此一般小塊組織固定20?40分鐘，大型材料不超過3?4小時。固定后用95%或純酒精洗滌，換液兩次，移到石蠟中或用80%酒精保存。8、 吉爾桑氏（Gilson）液配方60%酒精50毫升冰醋酸2毫升80%硝酸7.5毫升升汞10克蒸餾水440毫升這是常用的固定液，適用于肉質(zhì)菌類，特別是柔軟膠質(zhì)狀的材料如木耳等，也廣泛用于無脊椎動物和一般組織和蛙胚的固定。固定時間18?20小時，然后用50%酒精沖洗材料，除去升汞。如果用水沖洗，會使材料膨脹?；旌弦罕４?4小時后失效。9、 福爾馬林--醋酸--酒精溶液（FAA）液配方50%酒精85毫升福爾馬林10毫升冰醋酸5毫升這種固定液適用于固定一般植物莖、葉組織，昆蟲和甲殼類動物。液組織在這溶液里固定12小時，木質(zhì)化組織要固定1周，材料也可在此液中長期保存。固定后的材料放在50%酒精中沖洗1?2次。10、 克來寧堡氏（Kleinenberg's）液配方在20%硫酸水溶液內(nèi)加入苦味酸，直到飽和。這種固定液適用于雞胚的固定，也用于許多小型海洋生物的固定。11、 包因氏（Bouin's）液配方苦味酸飽和水溶液75毫升冰醋酸5毫升福爾馬林25毫升這是常用的良好固定劑，滲透迅速，固定均勻，組織收縮少，染色后能顯示一般的微細結構。一般動物組織、無脊椎動物的卵和幼蟲以及一般組織學、胚胎學的材料，如植物組織的根尖和胚囊都可用它來固定。一般組織固定24?48小時，小塊組織固定4?16小時，動物材料能在這種固定液中長期保存。固定后，動物材料用70%酒精沖洗凈苦味酸，到無黃色為止（用酒精沖洗時，加幾滴氨水，可加快除去黃色）；植物材料用20%酒精沖洗幾次。12、 紹丁氏（Schaudinn's）液配方甲液升汞飽和水溶液66毫升95%酒精33毫升乙液冰醋酸1毫升甲、乙液要在臨用前混合。這種固定液適用于固定有鞭毛的原生動物、植物的精子和游動抱子等。材料如制作涂布裝片，可在40攝氏度下固定10?20分鐘。13、眼球固定液配方丙酮40毫升冰醋酸1.5毫升升汞2克甲醛10毫升蒸餾水40毫升這種固定液適用于眼球的固定，并可在固定液中長期保存。14、 納瓦興氏(Nawaschin's)液配方甲液鉻酸1.5克冰醋酸10毫升蒸餾水90毫升乙液福爾馬林40毫升蒸餾水60毫升臨用前將等量甲、乙液混合。高等植物有絲分裂材料適宜在這種固定液里固定或長期保存。15、 綠色標本保存液配方一硫酸銅5克水95毫升這種保存液適用于綠色植物和一切植物綠色部分的保存。植物放入硫酸銅液后，由綠變黃，再由黃變綠。這時取出材料，用清水漂洗干凈，浸在5%福爾馬林液內(nèi)長期保存。配方二硫酸銅0.2克95%酒精50毫升福爾馬林10毫升冰醋酸5毫升水35毫升先把硫酸銅溶于水中，然后加入配方中的其他組分。綠色標本能長期的貯存在該液中。配方三醋酸銅15?30克50%醋酸100毫升在50%醋酸中逐漸加入醋酸銅，直到飽和。適用時取原液1份，加水4份，即成稀釋的硫酸銅溶液。這種保存液適用于表面有蠟質(zhì)、蛙質(zhì)、質(zhì)地較硬的綠色植物保色。加熱稀釋到醋酸銅溶液，放入植物，輕輕翻動，到植物由綠轉黃再轉綠色時取出植物，用清水漂洗后，浸入5%福爾馬林液內(nèi)保存。16、 紅色標本保存液配方一甲液硼酸3克福爾馬林4毫升水400毫升乙液亞硫酸2毫升硼酸10克水488毫升把紅色的果實浸在甲液里1?3天，等果實由紅色轉深棕色時取出，移到乙液里保存，同時在果實內(nèi)注入少量乙液。配方二氯化鋅2份福爾馬林1份甘油1份水40份先把氯化鋅溶解在水里，然后加入配方中其他組分。溶液如果渾濁而有沉淀，應過濾后使用。紅色果實能在此液中保存。17、 黃色標本保存液配方一甲液硫酸銅5克水95毫升乙液6%亞硫酸30毫升甘油30毫升95%酒精30毫升水900毫升先把植物標本在甲液中浸1?2天，取出洗凈后，浸入乙液中保存，同時在果實內(nèi)注入少量乙液。配方二6%亞硫酸568毫升80%酒精568毫升水450毫升植物材料