第二節(jié)動物細胞工程技術演示文稿

第二節(jié)動物細胞工程技術演示文稿目前一頁\總數(shù)五十四頁\編于八點優(yōu)選第二節(jié)動物細胞工程技術目前二頁\總數(shù)五十四頁\編于八點動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合動物細胞工程主要技術其它動物細胞工程的基礎單克隆抗體技術核移植目前三頁\總數(shù)五十四頁\編于八點一：動物細胞培養(yǎng)

目前四頁\總數(shù)五十四頁\編于八點一、動物細胞培養(yǎng)的概念和原理：1、概念：動物細胞培養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關的組織,將它分散成單個細胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細胞生長和增殖.2、原理：細胞增殖目前五頁\總數(shù)五十四頁\編于八點3.動物細胞培養(yǎng)的條件:1）營養(yǎng)：

4）氣體環(huán)境：2）無菌無毒的環(huán)境：3）溫度和pH：目前六頁\總數(shù)五十四頁\編于八點條件:1）營養(yǎng)：

對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具無菌處理；培養(yǎng)液中添加抗生素防止培養(yǎng)過程中污染；定期更換培養(yǎng)液以清除代謝產物，防止對培養(yǎng)細胞造成危害。2）無菌無毒的環(huán)境：

液體合成培養(yǎng)基：（糖、氨基酸）、促生長因子、（水、無機鹽、微量元素）等；通常還需加入血漿、血清等天然成分。目前七頁\總數(shù)五十四頁\編于八點條件:

適宜的溫度：人和哺乳動物細胞最適溫度為36.5±0.5℃。適宜的酸堿度：4）氣體環(huán)境：3）溫度和pH：

“95％空氣+5％CO2”的混合氣體培養(yǎng)箱。氧氣是細胞代謝必須的；CO2維持培養(yǎng)液的PH。目前八頁\總數(shù)五十四頁\編于八點問題1、動物血清的作用是什么？

以提供一個類似生物體的內環(huán)境；此外動物血清中也包含了一些動物的激素和酶，可以促進細胞的發(fā)育。目前九頁\總數(shù)五十四頁\編于八點胰蛋白酶處理取出組織胚胎或幼齡動物器官組織剪碎單個細胞細胞懸液轉入培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)①原代培養(yǎng)4：過程：圖示原代培養(yǎng)目前十頁\總數(shù)五十四頁\編于八點定義：人們通常將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。①原代培養(yǎng)4：過程：目前十一頁\總數(shù)五十四頁\編于八點問題2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？問題3、為什么在用酶處理前要先剪碎？因為其細胞生命力旺盛，分裂能力強，分化程度低。增大與酶的接觸面積。問題3、為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？擴大細胞與培養(yǎng)液的接觸面積，利與細胞吸收營養(yǎng)。目前十二頁\總數(shù)五十四頁\編于八點問題5：為什么用胰蛋白酶處理？

（動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，）

胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細胞間的蛋白質和細胞外的其他成分酶解，獲得單個細胞。

問題6：為什么用胰蛋白酶處理而不用胃蛋白酶？

動物細胞培養(yǎng)的最適PH值為7.2-7.4，胰蛋白酶作用的適宜PH為7.2-8.4，胃蛋白酶適宜PH為2.胃蛋白酶在PH為7.2-7.4的動物細胞培養(yǎng)中無活性。目前十三頁\總數(shù)五十四頁\編于八點問題7：用胰蛋白酶處理不會把所培養(yǎng)的細胞消化掉嗎？問題8、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？控制好時間！長時間處理當然會損傷細胞。不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體目前十四頁\總數(shù)五十四頁\編于八點問題8、動物細胞培養(yǎng)液有哪兩大特點？問題9、為什么會出現(xiàn)貼壁生長

1、貼壁生長2、接觸抑制大多數(shù)組織細胞不適應懸浮生長，必須在固定的表面上生長和分裂。問題10、如何解除接觸抑制：傳代培養(yǎng)目前十五頁\總數(shù)五十四頁\編于八點強調一：細胞貼壁過程■細胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。■培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于帖附。目前十六頁\總數(shù)五十四頁\編于八點■當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時,細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。強調二：接觸抑制目前十七頁\總數(shù)五十四頁\編于八點

定義：當原代培養(yǎng)的細胞處于接觸抑制后,用胰蛋白酶處理,使細胞從瓶壁上脫離下來,然后加入新的培養(yǎng)液,將細胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶內轉接到新的培養(yǎng)瓶內,這個過程稱傳代培養(yǎng).（分瓶培養(yǎng)的過程）細胞：分為細胞株和細胞系②傳代培養(yǎng)目前十八頁\總數(shù)五十四頁\編于八點問題11、如何界定原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)？細胞株、細胞系？原代培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)，通常把第一代至第十代以內的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)；將原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內，再進行培養(yǎng)，這個過程就稱為傳代培養(yǎng)。

細胞分裂10－50代為細胞株；分裂50代以上極為細胞系。

目前十九頁\總數(shù)五十四頁\編于八點▲細胞株：傳代細胞一般能傳到40-50代，遺傳物質一般不會發(fā)生改變，叫細胞株。強調：細胞系、細胞株▲細胞系：傳代50代以后不能再傳下去，部分細胞遺傳物質發(fā)生了改變，能連續(xù)傳代，獲得不死性，叫細胞系。目前二十頁\總數(shù)五十四頁\編于八點5、總結：動物細胞培養(yǎng)過程動物胚胎或幼齡動物的組織、器官配置細胞懸液剪碎用胰蛋白酶處理10代細胞轉入培養(yǎng)瓶40-50代細胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個細胞加培養(yǎng)液稀釋傳代10代以內，遺傳物質不改變，保持正常二倍體核型。傳代10-50代左右，增長緩慢以至于完全停止，部分細胞核型可能發(fā)生變化（遺傳物質可能改變）為什么用胰蛋白酶處理？分瓶傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)特點：細胞貼壁、接觸抑制繼續(xù)傳代培養(yǎng)少部分細胞獲得不死性，細胞突變，遺傳物質已經改變，等同于癌細胞。細胞株：一般說遺傳物質未改變細胞系：遺傳物質已改變原代培養(yǎng)目前二十一頁\總數(shù)五十四頁\編于八點6.動物細胞培養(yǎng)技術的應用:1.蛋白質生物制品的生產如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體2.應用于基因工程主要用于作為受體細胞3.檢測有毒物質，判斷某種物質的毒性

4.細胞的生理、藥理、病理研究

如用于篩選抗癌藥物目前二十二頁\總數(shù)五十四頁\編于八點植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較：比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理細胞的全能性細胞增殖培養(yǎng)基性質固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖促--動物血清培養(yǎng)結果植物體細胞株、細胞系培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株獲得細胞或細胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花藥胚胎或幼齡動物的器官或組織其他條件無菌無毒，適宜條件無菌無毒，適宜條件目前二十三頁\總數(shù)五十四頁\編于八點二動物細胞融合與單克隆抗體目前二十四頁\總數(shù)五十四頁\編于八點人—鼠細胞融合過程目前二十五頁\總數(shù)五十四頁\編于八點1、定義：指用自然或人工方法使兩個或多個不同的細胞融合成一個細胞的過程。一）、動物細胞融合◆細胞雜交：不同基因型的細胞之間的融合就是細胞雜交?！綦s交細胞：融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞成為雜交細胞。目前二十六頁\總數(shù)五十四頁\編于八點

細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合

受精作用目前二十七頁\總數(shù)五十四頁\編于八點動物細胞融合目前二十八頁\總數(shù)五十四頁\編于八點2、誘導融合的方法物理法：電激融合

化學法：聚乙二醇PEG誘導融合.生物法：滅活的病毒誘導融合.(動物細胞融合所特有的。

這是由于病毒的外殼——磷脂與動物細胞的膜十分相似的緣故。病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促進細胞融合的功能。)病毒顆粒黏附細胞表面細胞膜連接細胞膜被病毒顆粒穿通細胞融合、形成雜種細胞目前二十九頁\總數(shù)五十四頁\編于八點問題：

為什么細胞融合過程中使用的病毒需要滅活？不滅活行嗎？

因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。若不滅活則會感染細胞，且不能誘導細胞融合。目前三十頁\總數(shù)五十四頁\編于八點3、動物細胞融合技術的應用

意義：細胞融合技術突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。主要用途：利用雜交瘤技術，制備單克隆抗體。目前三十一頁\總數(shù)五十四頁\編于八點二）：動物細胞融合的成功應用

——單克隆抗體的制備目前三十二頁\總數(shù)五十四頁\編于八點人們獲得抗體的傳統(tǒng)方法是什么?將抗原注入動物體,然后從動物血清中提取抗體這種方法的缺點是什么?效率低，產量有限，純度低，動物抗體注入人體可能產生嚴重的過敏反應。運用已學知識，設想怎樣獲得單一類型的抗體？能否用單個B淋巴細胞通過克隆形成的細胞群來產生單一類型的抗體呢？-B淋巴細胞在體外不能無限增殖。思考目前三十三頁\總數(shù)五十四頁\編于八點單克隆抗體的制備—極富創(chuàng)造性的方案將能夠產生特定抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。雜交瘤細胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。米爾斯坦(阿根廷)和科勒(德國)因此在1984年獲諾貝爾獎。目前三十四頁\總數(shù)五十四頁\編于八點雜交細胞滅活的病毒等手段小鼠骨髓瘤細胞B淋巴細胞經免疫的小鼠提取雜交瘤細胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選能產生特定抗體、培養(yǎng)條件下能無限增殖的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔提取單克隆抗體目前三十五頁\總數(shù)五十四頁\編于八點問題：1）、本過程利用了哪些原理？

①免疫原理；

②細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理2）、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？

同種生物的細胞沒有免疫排斥反應；

融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質。（不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領，因而可以獲得大量單克隆抗體）目前三十六頁\總數(shù)五十四頁\編于八點3）、為何要進行兩次篩選？4）、如何進行第2次篩選？培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個雜交瘤細胞。第1次篩選得到雜交瘤細胞（多種）。第2次篩選得到能產生特異性抗體的雜交瘤細胞群。問題：目前三十七頁\總數(shù)五十四頁\編于八點

動物特異性免疫

分離B淋巴細胞（B）；找到骨髓瘤細胞（G）。注意B淋巴細胞是一個系列。（B1,B2,B3,---Bn）

細胞融合——三種融合方式:（BB;BG;GG）

第一次篩選：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選雜交瘤細胞（只有BG雜交瘤細胞存活。但BG雜交瘤細胞也是一個系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)雜交瘤細胞系列

，每孔只放一個雜交瘤細胞?！翱寺』囵B(yǎng)”每個雜交瘤細胞，并進行“單一抗體檢測”，“檢測陽性”的孔內即是所需要的雜交瘤細胞。

選擇所需要的雜交瘤克隆細胞群，體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內增殖。

提取單克隆抗體。1、單抗的制備過程要點：目前三十八頁\總數(shù)五十四頁\編于八點1、作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、體內腫瘤的定位等,與常規(guī)抗體相比,具有準確、高效、簡易、快速特點.2、用于治療疾病和運載藥物：主要用于癌癥治療。生物導彈：抗癌細胞的單克隆抗體+放射性同位素+化學藥物或細胞毒素。（單克隆抗體：導向—準確找到癌細胞位置；藥物—原位殺死癌細胞。）2、單克隆抗體的優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，可大量制備。3、單克隆抗體的應用目前三十九頁\總數(shù)五十四頁\編于八點三）、動物體細胞核移植技術和克隆動物1、定義：

動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核,移入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中.使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體.3、分類：

胚胎核移植、體細胞核移植。胚胎細胞分化程度低，恢復其全能性相對容易。動物體細胞分化程度高，恢復其全能性十分困難2、原理：

動物細胞核具有全能性目前四十頁\總數(shù)五十四頁\編于八點體細胞核移植過程---示動物克隆---無性繁殖克隆羊多利培育過程：黑面綿羊去核卵母細胞白面綿羊乳腺細胞核細胞核移植重組細胞電脈沖刺激早期重組胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利供體受體代孕受體目前四十一頁\總數(shù)五十四頁\編于八點核移植流程:1、供體（體）、受體（卵母）細胞的采集與培養(yǎng)4、電刺激促融使供體核進入受體卵母細胞，構建重組胚胎。3、將供體細胞與去核卵母細胞緊密接觸2、顯微操作去除卵母細胞中的核5、胚胎移植入代孕母牛體內6、妊娠分娩與供體遺傳物質基礎相同的犢牛。目前四十二頁\總數(shù)五十四頁\編于八點1）、克隆動物性狀與供體動物完全一樣嗎？2）、供體和受體動物可為同一個體嗎？可以。不完全！因為：一、供體動物只提供細胞核，而細胞質中的遺傳物質（如線粒體DNA）來自于受體卵母細胞.二、生物的性狀不僅與遺傳物質有關，還受環(huán)境的影響。問題：目前四十三頁\總數(shù)五十四頁\編于八點3）、為什么要對乳腺細胞進行饑餓處理？4）、除電刺激促融外，還有其他方法嗎？也可用顯微注射法。

核移植的乳腺細胞是經過細胞培育3～6代的細胞。

在饑餓狀態(tài)下，大部分細胞死亡，小部分轉入靜止期而實現(xiàn)脫分化。這些脫分化的細胞即可作核供體問題：目前四十四頁\總數(shù)五十四頁\編于八點二、動物細胞工程的應用快速繁殖優(yōu)良品種克隆轉基因動物拯救瀕危滅絕的動物培育人造器官目前四十五頁\總數(shù)五十四頁\編于八點4.體細胞核移植技術的應用前景目前四十六頁\總數(shù)五十四頁\編于八點5.體細胞核移植技術存在的問題目前四十七頁\總數(shù)五十四頁\編于八點

◆取供體細胞傳代培養(yǎng)10代以內的細胞.為什么？◆用的是去核的減數(shù)第二次分裂中期細胞（MⅡ中期）為什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：電刺激◆胚胎移植至代孕受體內

妊娠、分娩2.）核移植流程供體：優(yōu)質高產奶牛受體：普通奶牛（卵母細胞的采集與培養(yǎng)）

1.體積大，易操作。2.含有促使細胞核表達全能性的物質和營養(yǎng)條件。有人說它三個母親，對嗎？目前四十八頁\總數(shù)五十四頁\編于八點例題1：1975年，英國劍橋大學分子生物學實驗室的科勒和米爾斯坦，把小鼠的淋巴細胞（脾細胞）和小鼠的骨髓瘤細胞融合起來，成為雜交瘤細胞，實現(xiàn)在體外大量生產抗體的目的。實驗過程如圖所示。(1)淋巴細胞能與骨髓瘤細胞融合成一個細胞，兩種細胞膜也能“融合”

在一起，說明細胞膜

。(2)單克隆抗體的準確定義應為()A．一類特殊抗體B．無性繁殖系

C．單一抗體細胞的無性繁殖第產生的抗體

D．單一抗體細胞的有性繁殖系產生的抗體(3)雜交瘤細胞繁殖進行的是_______分裂，其遺傳性狀__________。(4)單克隆抗體注入體內后可以自動追蹤抗原(病原體或癌變細胞等)并與之結合，而絕不攻擊任何正常細胞，故稱為“生物導彈”這是利用了

_____________

。具有一定的流動性C有絲不變抗體能與抗原發(fā)生特異性結合的特點目前四十九頁\總數(shù)五十四頁\編于八點已知細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細胞中盡管沒有S途徑，但能不斷分裂增殖，將這兩種細胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細胞。請回答：（1）試管中除融合的雜種細胞外，還有

種融合細胞。（2）設計一方法（不考慮機械方法），從培養(yǎng)液中分離出雜種細胞，并說原理。方法：

。原理：培養(yǎng)液中加入氨基嘌呤，收集增殖的細胞加入氨基嘌呤后,使D合成的途徑阻斷,所以僅D合成途徑的骨髓瘤細胞或彼此融合的細胞就不能增殖,但雜種細胞則可以利用淋巴細胞中的S途徑合成DNA而增殖目前五十頁\總數(shù)五十四頁\編于八點

[例題2]（1）在用動物細胞融合技術制備單克隆抗體時，將抗原注射到小鼠體內，可獲得(多選)

（）

A．T淋巴細胞B．效應B淋巴細胞

C．抗體D．記憶細胞（2）下列關于單克隆抗體的制備和應用的敘述中，正確的是(多選)（）

A．B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合，一般需要滅活的仙臺病毒或聚乙二醇誘導

B．融合后形成的雜交瘤細胞既能無限增殖，又能產生單克隆抗體

C．體外培養(yǎng)時，一個B淋巴細胞可以產生一種抗體，但不能無限增殖

D．單克隆抗體與常規(guī)抗體相比，特異性強，靈敏度高，優(yōu)越性明顯

BCD

ACD目前五十一頁\總數(shù)五十四頁\編于八點黑面綿羊去核卵母細胞白面綿羊乳腺細胞核a重組細胞電脈沖刺激早期重組胚胎b另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利1、寫出AB所代表細胞工程名稱：a表示：

b表示:

2、實施細胞工程時，所需受體細胞大多采用卵母細胞的原因：體積大，易操作。含有促使細胞核表達全能性的物質和營養(yǎng)條件。3、多利面部毛色是：