高效液相色譜法的應(yīng)用

高效液相色譜法的應(yīng)用第1頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四請(qǐng)大家將手機(jī)調(diào)整到“振動(dòng)”檔！

謝謝您的配合！第2頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四授課內(nèi)容（1）HPLC儀器的介紹，基礎(chǔ)知識(shí)。

（2）方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深入剖析。

（3）在新藥申報(bào)資料中應(yīng)注意的問(wèn)題和事項(xiàng)。

（4）從溶出度研究引申至國(guó)產(chǎn)口服固體制劑與進(jìn)口原研制劑的差距。申請(qǐng)ANDA（美國(guó)仿制藥申請(qǐng)）和OEM（制劑委托加工）的技術(shù)要點(diǎn)。

（5）剖析中國(guó)藥典中有待商榷之處，使大家舉一反三、融會(huì)貫通！

（6）為學(xué)員們解答各種問(wèn)題。第3頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四理念與思路工作中應(yīng)注意總結(jié)，理論聯(lián)系實(shí)際，重視文獻(xiàn)的查詢，不要匆匆忙忙地就進(jìn)行試驗(yàn)，搞清楚原理，做好試驗(yàn)計(jì)劃、設(shè)計(jì)好試驗(yàn)后，再有條不紊地進(jìn)行。試驗(yàn)期間不要怕遇到問(wèn)題，越是遇到問(wèn)題，解決問(wèn)題，提高得越快，如果長(zhǎng)時(shí)間都沒(méi)有問(wèn)題，都“一帆風(fēng)順”，那將沒(méi)有提高!第4頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四理念與思路1）“搞分析”就是“搞誤差”！

2）只有把握住誤差，才能科學(xué)、辨證地做到“知識(shí)的活學(xué)活用”！

3）做到技術(shù)上的“粗放自如”、“張持有度”，需要不斷地體會(huì)和領(lǐng)悟！第5頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四信息查詢/國(guó)家藥監(jiān)局新藥審評(píng)中心網(wǎng)站

/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站

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維普數(shù)據(jù)庫(kù)

萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)第6頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四HPLC儀的一般操作1.

幾大儀器生產(chǎn)廠商的介紹和使用下來(lái)的體會(huì)。包括國(guó)內(nèi)目前可以生產(chǎn)的部件；根據(jù)自己工作需要購(gòu)買某一品牌。

2.

流動(dòng)相的配制（梯度洗脫）和處理（過(guò)濾膜）

3.

柱子的安裝。

4.

操作順序

5.

平衡時(shí)間

6.

如有氣泡，如何處理。第7頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）分析生化樣品、血液制品和手性色譜柱時(shí)，最好加一預(yù)柱以保護(hù)。

（2）配備柱溫箱，以保證試驗(yàn)的重現(xiàn)性和降低柱壓等

（3）最好能配一電腦和國(guó)產(chǎn)軟件。不要用積分儀。

（4）壓力不穩(wěn)時(shí)，絕大多數(shù)情況是有氣泡混入。應(yīng)排除。

（5）試驗(yàn)后色譜柱沖洗。

（6）色譜柱不用、存放時(shí)，兩頭柱塞一定塞住，否則容易揮發(fā)干損傷柱子。

（7）建立儀器使用登記本。

（8）

儀器維修培養(yǎng)一位同志第8頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1．定義:HPLC——highperformanceliquidchromatography

2．分析物質(zhì)的分子量大小——分子量一般在200~1000之間，太大的分子量（如多肽類等）導(dǎo)致脫尾嚴(yán)重，此時(shí)可采用其他方法進(jìn)行分析，如毛細(xì)管電泳，凝膠色譜等。第9頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.分析的特點(diǎn)

適用范圍寬：現(xiàn)在決大部分化學(xué)類藥品皆可采用該儀器分析。

分離效率高：復(fù)方分析、輔料干擾時(shí)等情況下，更顯示其威力。

速度快：一般出峰時(shí)間均在30min以內(nèi)。這里需要強(qiáng)調(diào)的是，通常采用流速為1.0ml/min，柱溫30~40℃的測(cè)定條件。一般含量測(cè)定、溶出度可調(diào)整為出峰時(shí)間快一些，有關(guān)物質(zhì)測(cè)定一般調(diào)整的慢一些，最好10~15min左右出峰為好。。第10頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四流速和柱溫均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)測(cè)定的需要。如含量測(cè)定時(shí)，可適當(dāng)加大流速和提高柱溫；柱溫降低和流速降低均可對(duì)分離效果提高。順便提級(jí)：同樣的測(cè)定條件，不同公司生產(chǎn)的色譜柱C18柱，出峰時(shí)間都有可能相差很大。這十分正常。目前國(guó)外已基本采用一根色譜柱對(duì)一個(gè)產(chǎn)品，特別是一些特殊的柱型，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均詳細(xì)注明。國(guó)內(nèi)雖做不到，但可在色譜條件上下工夫，以適應(yīng)不同的色譜柱型號(hào)，即后面即將講到的方法認(rèn)證中的系統(tǒng)耐用性。第11頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四靈敏度高：可檢測(cè)物質(zhì)達(dá)10-9g左右，一般最低檢測(cè)濃度均可達(dá)10-1~10-3μg/ml（進(jìn)樣體積10~20μl）。這是紫外測(cè)定無(wú)法匹敵的。有些濃度非常低的，紫外檢測(cè)不到或者說(shuō)紫外無(wú)法測(cè)定的，應(yīng)用HPLC法均可得到滿意的解決！并可通過(guò)使用不同的檢測(cè)器，測(cè)定不同物質(zhì)，或再提高測(cè)定靈敏度。

色譜柱可反復(fù)使用：一般保存好，均可達(dá)2年以上。

流出的組分容易收集：可用于制備色譜或價(jià)格極為昂貴的物質(zhì)收集。第12頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四安全：僅有一些有機(jī)溶劑的污染（使用時(shí)，流動(dòng)相口要密封，一者以免揮發(fā)，流動(dòng)相中各組分比例不準(zhǔn)，二者防止揮發(fā)，污染環(huán)境），比氣相要安全的多。

還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是成功率較高：一般條件確定好后，均可得滿意的結(jié)果，這也是與氣相、毛細(xì)管電泳比最大的優(yōu)點(diǎn)。第13頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4．分離原理就是利用不同物質(zhì)間的細(xì)微差別，使得在色譜柱上所顯現(xiàn)的保留行為有所不同進(jìn)行分離測(cè)定。主要是能夠分離。

兩個(gè)主要參數(shù)：(1)柱效用理論板數(shù)來(lái)表達(dá)：上面兩式需要注意的是：第一個(gè)為基本公式，好的軟件均可自動(dòng)計(jì)算出；第二個(gè)公式為推導(dǎo)公式，即假設(shè)拖尾因子為1.0，即色譜峰完全對(duì)稱時(shí)，用峰面積和峰高來(lái)表示半峰寬，因此兩者是有區(qū)別的，當(dāng)峰形拖尾或前沿嚴(yán)重時(shí)，兩者差異將較大。第14頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5.色譜柱類型C18柱（ODS是其中的一種，主要區(qū)別是將未鍵合的OH基遮蓋，而ODS是其商品名）、C8柱、氨基柱、苯基柱、陽(yáng)（陰）離子交換色譜柱等，這些都是固定相表面鍵合的極性有機(jī)基團(tuán)不同所至。

不能混用。第15頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四6.流動(dòng)相常用溶劑的極性和截止波長(zhǎng)由極性可以看出，在反相色譜中，要使出峰時(shí)間加快，可增加流動(dòng)相中的乙腈比例，但要注意分離度的減?。蝗粢钩龇鍟r(shí)間減慢，可增加流動(dòng)相中水的比例，增加水的比例還會(huì)引起分離度的增加；兩者之間綜合來(lái)考慮。舉例說(shuō)明。異丙醇轉(zhuǎn)相時(shí)必須用；四氫呋喃使用時(shí)注意波長(zhǎng)。必須選用色譜級(jí)的。

梯度洗脫的注意事項(xiàng)：流動(dòng)相、測(cè)定波長(zhǎng)、預(yù)先混合的比例第16頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四由于甲醇的極限波長(zhǎng)為210nm左右，故短波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，最好不要采用甲醇，而用乙腈。

樣品稀釋用溶劑的選擇：測(cè)定有關(guān)物質(zhì)時(shí)最好選用流動(dòng)相，避免以溶劑峰的干擾，水往往出倒峰。含量測(cè)定時(shí)，溶劑依情況而定，有時(shí)選用流動(dòng)相費(fèi)用太高，或是不易于操作。

進(jìn)樣量最好選用定量環(huán)的量，以避免由于進(jìn)樣不準(zhǔn)而引起的偏差。定量環(huán)可進(jìn)行更換。第17頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四7.檢測(cè)器類型最通用的紫外檢測(cè)器：注意測(cè)定波長(zhǎng)較短時(shí)，基線有可能會(huì)飄；洗柱子時(shí)，盡量關(guān)閉光源，以延長(zhǎng)使用壽命。

二極管陣列檢測(cè)器：目前使用者越來(lái)越多。用于多波長(zhǎng)檢測(cè)、峰純度測(cè)定、對(duì)被測(cè)定物質(zhì)進(jìn)行紫外掃描后選擇波長(zhǎng)等用途。

熒光檢測(cè)器：靈敏度更高，對(duì)那些μg級(jí)的制劑品種，有時(shí)適用。但缺點(diǎn)是，基線穩(wěn)定需平衡時(shí)間較長(zhǎng)。

示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)檢測(cè)器）等。第18頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四8．定量分析8.1外標(biāo)法：計(jì)算公式

使用時(shí)應(yīng)注意盡量保持樣品溶液和對(duì)照品溶液濃度相同第19頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四8.2內(nèi)標(biāo)法

使對(duì)照品溶液和樣品溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度一致，否則計(jì)算將極為煩瑣。該法僅是由于以前儀器的性能還不十分精確，進(jìn)樣體積還不能準(zhǔn)確控制的很準(zhǔn)時(shí)，才采用的?，F(xiàn)在隨著定量閥和自動(dòng)進(jìn)樣器的使用，該法使用已越來(lái)越少，而且相反會(huì)引起不必要的誤差，除非進(jìn)樣閥進(jìn)樣量不準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)急采用。但該法在氣相色譜中還是十分具有價(jià)值的。第20頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第21頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四8.3歸一化法和自身對(duì)照法

為有關(guān)物質(zhì)（雜質(zhì)）的測(cè)定方法。這是通過(guò)峰面積的比較來(lái)推算出各物質(zhì)質(zhì)量比例的方法。目前多采用自身對(duì)照法來(lái)進(jìn)行。

(1)歸一化法：即一個(gè)峰的峰面積（雜質(zhì)峰）占總峰面積或占主峰面積的多少。由于有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)，總峰面積的絕大部分均為主峰面積，故兩者結(jié)果差不多，結(jié)果基本一致。。第22頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四(2)自身對(duì)照法：通常是將供試品溶液稀釋一定倍數(shù)后（通常為100倍）作為對(duì)照溶液（這里對(duì)照溶液與對(duì)照品溶液的區(qū)別需要強(qiáng)調(diào)一下），將其和供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，供試品溶液色譜圖中的每個(gè)雜質(zhì)峰面積，與對(duì)照溶液主成分峰面積進(jìn)行比較或計(jì)算進(jìn)行對(duì)雜質(zhì)的判斷。如比較，直接比峰面積大小，如計(jì)算，則采用公式計(jì)算雜質(zhì)含量。第23頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四這里，需要講解的是：如果該物質(zhì)線性關(guān)系良好，稀釋100倍，峰面積還呈線性的話，那么，歸一化法和自身對(duì)照法所得結(jié)果基本是一致的（最多差0.02%左右）。但如果稀釋100倍，峰面積不呈線性的話，那么，歸一化法和自身對(duì)照法所得結(jié)果將有所差異，如此時(shí)采用歸一化法，將得不到較為正確的結(jié)果，因?yàn)榇藭r(shí)，峰面積已不能較為準(zhǔn)確地表示質(zhì)量；而采用自身對(duì)照法，則可避免該情況的發(fā)生，這也是目前推薦采用該法的原因所在。但大家可以注意，目前你們測(cè)定的化合物，稀釋100倍，通常，峰面積是呈線性的，原因是因?yàn)椴捎米贤鈾z測(cè)器，一般化合物的線性范圍可達(dá)1~106或107，但也有一些測(cè)定物質(zhì)，線性范圍較窄，此時(shí)便需要摸索其范圍，但又不能單純考慮線性范圍，還應(yīng)著重考慮供試品溶液的濃度才是最為重要的。第24頁(yè)，共25頁(yè)，2023年，2月20日，星期四9．流動(dòng)相的調(diào)節(jié)為了得到較好的分離效果和柱效，有時(shí)要在流動(dòng)相中加入一些少量的有機(jī)溶劑，如三乙胺來(lái)調(diào)節(jié)峰形變“瘦”；或加入緩沖鹽，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值或離子強(qiáng)度，以改變組