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文檔簡介

氨基酸紙層析

知識目標

技能目標學習紙層析法的基本原理掌握紙層析法對混合氨基酸進行分離和鑒定的技術(shù)。

實驗原理紙層析法（paperchromatography）是生物化學上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機酸、維生素、抗菌素等物質(zhì)的一種分離分析工具。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機溶溶劑是流動相。在層析時，將樣品點在距濾紙一端約2～3cm的某一處，該點稱為原點；然后在密閉容器中層析溶劑沿濾紙的一個方向進行展層，這樣混合氨基酸在兩相中不斷分配，由于分配系數(shù)（Kd）不同，結(jié)果它們分布在濾紙的不同位置上。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置可用比移值（rateofflow,Rf）來表示。所謂Rf，是指在紙層析中，從原點至氨基酸停留點（又稱為層析點）中心的距離（X）與原點至溶劑前沿的距離（Y）的比值：

實驗原理在一定條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、溫度、濕度、層析濾紙的型號和質(zhì)量等因素有關(guān)。

實驗過程1.準備濾紙取層析濾紙（長22㎝、寬14㎝）一張，在紙的一端距邊緣2～3㎝處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔3㎝作一記號，如右圖所示。2.點樣用毛細管將各氨基酸樣品分別點在這4個位置上，干后重復點樣2～3次。每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm。3.擴展用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20ml擴展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1㎝）。待溶劑上升15～20㎝時即取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風機熱風吹干。

實驗過程4.顯色用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后用吹風機吹干或者置烘箱中（100℃）烘烤5min即可顯出各層析斑點。5.計算計算各種氨基酸的Rf值。

要點處理1.取濾紙前，要將手洗凈，這是因為手上的汗?jié)n會污染濾紙，并盡可能少接觸濾紙；如條件許可，也可戴上一次性手套拿濾紙。要將濾紙平放在潔凈的紙上，不可放在實驗臺上，以防止污染。2.點樣點的直徑不能大于0.5㎝，否則分離效果不好，并且樣品用量大會造成“拖尾巴”現(xiàn)象。3.在濾紙的一端用點樣器點上樣品，點樣點要高于培養(yǎng)皿中擴展劑液面約1cm。由于各氨基酸在流動相（有機溶劑）和固定相（濾紙吸附的水）

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