生物學(xué)中“Blotting”方法的簡介及總結(jié)

第頁共頁關(guān)于生物學(xué)中“Blotting”方法的簡介及總結(jié)關(guān)于生物學(xué)中“Blotting”方法的簡介及總結(jié)簡介：印跡〔blotting〕是生物學(xué)實(shí)驗中常用的檢測和分析^p方法。印跡〔blotting〕實(shí)驗的過程可以簡單描繪為將待檢測的生物大分子經(jīng)電泳等方法別離后轉(zhuǎn)移并固定在膜〔如：硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜〕上，然后用特異性識別物質(zhì)〔如探針〕去識別，最后經(jīng)顯色反響〔同位素放射自顯影、熒光、化學(xué)發(fā)光等〕在膜上顯示出結(jié)果：印跡。最早出現(xiàn)的blotting技術(shù)是SouthernBlotting，它是檢測DNA的一種方法。這項技術(shù)由英國生物學(xué)家EdwinSouthern在20世紀(jì)70年代創(chuàng)造，科學(xué)界便以創(chuàng)造者的名字來命名這項技術(shù)SouthernBlotting。1977年，美國斯坦福大學(xué)的JamesAlwine，DavidKemp，和GeorgeStark在PNAS上發(fā)表文章，提出了類似于SouthernBlotting，但卻是用來檢測RNA的技術(shù)。由于跟SouthernBlotting比擬相近，于是便有了NorthernBlotting這個名稱。后來，GeorgeStark又創(chuàng)造了用于檢測蛋白質(zhì)的blotting技術(shù)，W.NealBurte玩了一把“文字游戲”將這項技術(shù)命名為WesternBlotting，這個名字很快也被廣泛承受并流行起來。WesternBlotting與SouthernBlotting、NorthernBlotting的區(qū)別其實(shí)，WesternBlotting與SouthernBlotting、NorthernBlotting的技術(shù)原理差異還是比擬大的。這種差異表達(dá)在SouthernBlotting和NorthernBlotting是基于DNA和RNA分子之間堿基互補(bǔ)配對的特異性識別才能，而WesternBlotting那么基于抗原抗體之間特異的'免疫反響。SouthernBlotting和NorthernBlotting時使用帶有標(biāo)記〔如同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記〕的DNA或RNA探針去識別并結(jié)合到待檢測核酸上，然后直接顯影；而WesternBlotting時要先用待檢測蛋白的“一抗”結(jié)合到待檢測蛋白上，再用可識別“一抗”并偶聯(lián)了某種酶的“二抗去檢測”一抗“，最后通過顯色反響的信號來顯示待檢測蛋白的存在與否及量的多少。另外，SouthernBlotting和NorthernBlotting兩者比擬容易混淆。這兩種技術(shù)最關(guān)鍵的區(qū)別在于待檢測核酸的屬性，假如被檢測的是DNA，那么該技術(shù)就是SouthernBlotting，其探針可以是DNA也可以是RNA；類似地，假如被檢測的是RNA，不管探針是RNA還是DNA，該方法就叫作NorthernBlotting。除了以上三種Blotting技術(shù)，還有兩種不太常見的Blotting技術(shù)：EasternBlotting和Southwesternblotting。EasternBlotting是一種檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾的技術(shù)，其檢測目的是蛋白質(zhì)上特定的修飾基團(tuán)或部位，如脂肪酸鏈、糖基、磷酸化的氨基酸等等。在EasternBlotting實(shí)驗中，通常要先用2D電泳將蛋白質(zhì)別離，然后轉(zhuǎn)到膜上，再用特異的探針去檢測。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能過程中普遍存在的調(diào)控手段！Southwesternblotting是一種檢測DNA和蛋白質(zhì)互作的方法，因此才有Southwestern之稱。首先用SDS的方法將蛋白質(zhì)別分開來并轉(zhuǎn)移到膜上，然后在尿素的存在下去除SDS使蛋白盡可能復(fù)性，最后用帶標(biāo)記的特定序列的DNA探針去檢測。以上簡單介紹的幾種Blotting技術(shù)都以檢測某種生物大分子的存在〔或量的多少〕為目的，所使用的去識別待檢測物質(zhì)的探針或抗體與待檢測物質(zhì)之間的結(jié)合是的、確定的。在這一點(diǎn)上做文章，就可以把blotting技術(shù)推廣到驗證蛋白質(zhì)互相作用這個領(lǐng)域。Far-westernblotting是一種基于westernblotting的分子生物學(xué)方法，在westernblotting中用抗體來檢測目的蛋白，而在far-westernblotting中用可以與目的蛋白結(jié)合的非抗體蛋白質(zhì)。因此，westernblotting用來檢測特定的蛋白而far-westernblotting那么用于檢測蛋白質(zhì)之間的互相作用。在傳統(tǒng)的westernblotting中，凝膠電泳被用來從樣品中別離蛋白質(zhì)，然后這些蛋白質(zhì)在blotting過程中被轉(zhuǎn)移到膜上。目的蛋白在westernblot中被抗體探針識別。far-westernblotting用非抗體蛋白來檢測目的蛋白，通過這種方式，與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)就被檢測出來了。探針蛋白經(jīng)常通過一種表達(dá)克隆載體在大腸桿菌中被消費(fèi)出來。探針蛋白可以通過一種常規(guī)的