小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)-形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

XXX大學(xué)1-小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)XXX大學(xué)XX醫(yī)學(xué)院XX級(jí)XXXX班XXX指導(dǎo)老師：XXX【摘要】[目的]1.建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HCa—F細(xì)胞模型，對(duì)腫瘤侵襲與淋巴道轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性有所認(rèn)識(shí)；2.進(jìn)一步了解動(dòng)物尸體解剖、組織取材、染色的過(guò)程；3.強(qiáng)化科研思維的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練。[方法]將小鼠腹水型肝癌淋巴道低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(HCa—F經(jīng)615小鼠左側(cè)足墊接種的方法獲得淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤1代細(xì)胞HCa—P／L，再經(jīng)小鼠淋巴系統(tǒng)篩選5次，篩選高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HCa—F。[結(jié)果]觀察記錄28天，20只全部存活,未見(jiàn)明顯的淋巴結(jié)腫大或腫瘤形成，其他組織器官未發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)異常。鏡下可見(jiàn)淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞異型性明顯。[結(jié)論]可移植性小鼠腹水癌經(jīng)淋巴道向其他部位發(fā)生轉(zhuǎn)移?！続bstract】EstablishmentofmouseascitichepatomalymphaticmetastaticcelllineHCa-Fcellmodel.[Methods]Tomurineascitichepatomalymphaticmetastasiscelllines(HCa-F615mouseleftfootsubcutaneousinoculationmethodforobtaininglymphnodesRadioactiveseed1generationcellHCa-F,andthenbymurinelymphaticsystemscreening5,screeninghighmetastaticcelllineHCa–F.[Results]Observationrecordof28days;5survivednottoformtumorsinotherorgansrevealednoabnormalities.buttheatypiaofthetumorcellcanobservedinlymphnodeinlightmicroscope.[Conclusions]Portabilitymiceasctiescancerviathelymphaticwaytootherpartsoftheshift.【關(guān)鍵詞】小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株（HCa-F）;615小鼠淋巴道轉(zhuǎn)移【Keywords】murineascitichepatocarcinomacellstrain（HCa-F）;metastasis前言：轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的最重要標(biāo)志和最本質(zhì)表現(xiàn)，也是腫瘤所致患者死亡的最主要原因。早期發(fā)現(xiàn)并防止腫瘤轉(zhuǎn)移是改善病人預(yù)后的重要手段。因此，腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及防治已成為當(dāng)今腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。H22腫瘤瘤株屬小鼠的肝細(xì)胞瘤,系1952年蘇聯(lián)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究院(莫斯科)用O-Ptoaminoa-zotolyol(OAAT)涂C3H小鼠的皮膚100次后誘發(fā),皮下傳代的肝臟實(shí)體瘤。1963年中科院上海藥物所引進(jìn)后將肝臟實(shí)體型瘤株變成腹水型瘤株(其腹水型又稱(chēng)Hca,HAC或HepA),被廣泛應(yīng)用于腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制研究及藥物篩選。它們經(jīng)615小鼠局部皮下注射后，特異地向引流淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HCa—F細(xì)胞模型，對(duì)腫瘤侵襲與淋巴道轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性有所認(rèn)識(shí)。了解腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移。研究姜黃素對(duì)小鼠腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(HCa-F)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移行為的影響。方法體外實(shí)驗(yàn)中用15~250μmol/L姜黃素分別處理HCa-F細(xì)胞48h,以MTT法檢測(cè)HCa-F細(xì)胞的生長(zhǎng)活性;以生長(zhǎng)曲線(xiàn)評(píng)估姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖的影響;以流式細(xì)胞儀檢測(cè)姜黃素對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,于615小鼠腹腔、足墊接種HCa-F細(xì)胞,通過(guò)ip給藥的方法,觀察姜黃素對(duì)腹腔接種HCa-F細(xì)胞的615小鼠生存率的影響和對(duì)HCa-F細(xì)胞在615小鼠淋巴道轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果姜黃素可抑制HCa-F細(xì)胞的生長(zhǎng),對(duì)HCa-F細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為7。23%~82。23%,呈劑量依賴(lài)性,IC50為51。48μmol/L。以非細(xì)胞毒性最大劑量15μmol/L姜黃素作用48h后,HCa-F細(xì)胞的群體倍增時(shí)間增加,生長(zhǎng)速度受到抑制,細(xì)胞周期被重新分布,阻滯于S期。姜黃素ip給藥50mg/kg抑制小鼠腹水瘤的生長(zhǎng),延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期,使瘤細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移率從70%下降到40%。結(jié)論姜黃素可抑制小鼠腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(HCa-F)的增殖與轉(zhuǎn)移。【正文】實(shí)驗(yàn)材料1. 研究對(duì)象（1）細(xì)胞系：高轉(zhuǎn)移力小鼠腹水型肝癌細(xì)胞，由大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室建株并保存。（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6~8周齡，體重18~22g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2. 主要試劑及器皿搪瓷盆、溫度計(jì)、離心管、1ml注射器、手術(shù)刀、眼科手術(shù)剪、眼科手術(shù)鑷、乳膠手套、生理鹽水、1%來(lái)蘇兒溶液、75%酒精棉、10%甲醛固定液等。研究方法細(xì)胞系獲?。簭囊旱拗腥〕龈咿D(zhuǎn)移力小鼠腹水型肝癌細(xì)胞（HCa-F）塑料凍存管，立即放入40℃的溫水中，1分鐘內(nèi)使凍存液全部融化，立即送入無(wú)菌室中。取出細(xì)胞懸液放入離心管中，用生理鹽水洗滌2次，離心，棄上清，再加1ml生理鹽水吹打混勻。向小鼠腹腔內(nèi)接種0.2mlHCa-F細(xì)胞懸液（約6×106個(gè)腫瘤細(xì)胞），于第六天無(wú)菌條件取腹水。615小鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞：取615小鼠癌性腹水0.2ml，內(nèi)含4×106個(gè)活瘤細(xì)胞，接種于615小鼠右腋中線(xiàn)皮下和后右側(cè)足墊皮下，嚴(yán)格消毒。選擇右腋皮下，一方面便于觀察瘤塊的生長(zhǎng)，另一方面該處的血液循環(huán)好，有利于瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。選擇左足墊皮下是用于對(duì)比不同部位瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況。注射針頭進(jìn)入皮下（真皮下），若針頭能自由拔動(dòng)無(wú)牽連，注入注射液后形成小泡，則是皮下無(wú)誤。由于皮下組織較松，注射液很快擴(kuò)散，一定時(shí)間小泡可消失。定期檢查右腋和左足墊皮下腫瘤生長(zhǎng)和同側(cè)腋窩淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)腫大情況，于接種后28天處死全部小鼠，取皮下瘤體及雙側(cè)有關(guān)淋巴結(jié)稱(chēng)重，同時(shí)觀察肺、肝、腎等臟器。將上述組織固定于10%甲醛固定液中，石蠟包埋制片。HE染色，顯微鏡檢查。組織取材：將皮下瘤體、淋巴結(jié)、肺、肝、腎選取病變部位，切成厚2~3mm的小于2cm×1cm大小的組織塊，10%中性甲醛固定。小塊組織一般固定數(shù)小時(shí)，較大標(biāo)本需固定24~48小時(shí)。經(jīng)沖洗（用遞升濃度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蠟（用石蠟）、然后用石蠟將組織包埋成蠟塊，再經(jīng)切片機(jī)切片和染色制成切片。一般常規(guī)作蘇木精-伊紅染色。切片染色：石蠟切片法、HE染色法。（1）脫水程序及時(shí)間：組織固定，沖洗，然后：1）脫水：依下列順序進(jìn)行：60%酒精30分鐘→80%酒精1~2小時(shí)→95%酒精2~4小時(shí)或過(guò)夜→95%酒精2~4小時(shí)→100%酒精2~4小時(shí)→100%酒精2~4小時(shí)或過(guò)夜。2）透明：二甲苯Ⅰ30~45分鐘；二甲苯Ⅱ30~45分鐘。3）浸蠟：蠟碗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（各30~45分鐘）；包埋。4）修蠟塊：修蠟塊，貼號(hào)。5）切片：切片。6）烘烤：烘烤切片60~70℃，1小時(shí)。7）染色：染色。（2）HE切片染色程序與方法1）切片脫蠟水洗（與脫水過(guò)程相反）：將烘干的切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5~10分鐘（非常關(guān)鍵，寧長(zhǎng)勿短，主要目的是為了將石蠟洗掉）。無(wú)水酒精3~10分鐘（消除二甲苯）→95%酒精1~3分鐘→80%酒精1~3分鐘→70%酒精1~3分鐘→50%酒精1~3分鐘→自來(lái)水沖洗5分鐘以上（洗去切片上的酒精，切片透明）→蒸餾水清洗（防止污染蘇木精染液）。脫蠟是水化過(guò)程，目的是通過(guò)酒精的緩沖作用，易于水洗與染色。因?yàn)槿疽喝軇┦撬?，從無(wú)水酒精直接放入染液中容易引起激烈的擴(kuò)散作用，造成切片漂浮脫落或損傷組織。而經(jīng)各級(jí)濃度酒精緩沖后即可避免發(fā)生這種現(xiàn)象。2）HE染色：蘇木精-伊紅染色是先用蘇木精將組織切片適當(dāng)?shù)倪^(guò)染，經(jīng)水洗后再用鹽酸酒精分化，弱堿性水溶液顯藍(lán)。使胞核呈鮮明的藍(lán)色，胞質(zhì)及背景無(wú)色。再經(jīng)水洗后用伊紅染胞質(zhì)，染成深淺不同程度的粉紅色至紅色。蘇木浸染（染核）5~15分鐘（統(tǒng)一時(shí)間10分鐘）→自來(lái)水沖洗3~5分鐘→0.5%~1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘（分化）→自來(lái)水洗1~5分鐘→弱堿性水溶液顯藍(lán)30~60秒（或60℃熱水5分鐘）→自來(lái)水沖洗5~10分鐘→蒸餾水洗1~2次→伊紅1分鐘→蒸餾水洗1~2次。3）脫水、透明、封固：脫水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部處凈，經(jīng)透明劑的作用后，將脫水劑清除出來(lái)，使切片產(chǎn)生適宜的折光率。最后用蓋玻片及封固劑封固，便于觀察和長(zhǎng)期保存。80%酒精30~40秒→95%酒精30~60秒→無(wú)水酒精Ⅰ1~5分鐘→無(wú)水酒精Ⅱ1~5分鐘→二甲苯Ⅰ1~5分鐘→二甲苯Ⅱ1~5分鐘→中性樹(shù)膠封固。5．20只小鼠，其中全發(fā)生腹水型肝癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，在各淋巴結(jié)中均可見(jiàn)異型性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移率為100%，但并未造成明顯的相關(guān)器官發(fā)生病變。研究結(jié)果：觀察記錄28天；20只全部存活，取存活的小鼠肝臟和淋巴結(jié)進(jìn)行檢查，淋巴結(jié)及肝臟肉眼未見(jiàn)腫大及明顯變化。其中有8只，鏡下可見(jiàn)淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞異型性明顯及腫瘤病灶即癌巢，其他組織器官未發(fā)現(xiàn)異常。研究結(jié)論：小鼠腹水型肝癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為40%，并可造成相關(guān)器官發(fā)生病變。【結(jié)果】1．建模后飼養(yǎng)28天，解剖，皮下未見(jiàn)任何瘤樣組織，淋巴結(jié)腫大，肝腎肺等組織器官未見(jiàn)大體明顯異型性改變，鏡下可見(jiàn)少許腫瘤細(xì)胞。2．同側(cè)腋下淋巴結(jié)：大體：與正常淋巴結(jié)相比略大，呈卵圓形，質(zhì)硬，切面灰白色。ＬＭ：在淋巴結(jié)的邊緣竇處可看到某些細(xì)胞分布不規(guī)律，細(xì)胞體積較大、形態(tài)不一，核較大，胞質(zhì)藍(lán)染，組織生長(zhǎng)雜亂，細(xì)胞異型性明顯，表明此淋巴結(jié)中的腫瘤組織是原發(fā)病灶的腫瘤經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移的結(jié)果。3．肺、肝、腎；大體：未見(jiàn)明顯異常ＬＭ：可見(jiàn)到組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的異型性，組織結(jié)構(gòu)被破壞，腫瘤細(xì)胞異型性明顯。說(shuō)明腫瘤細(xì)胞在發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的同時(shí)也發(fā)生了血液轉(zhuǎn)移。4．20只小鼠，其中全發(fā)生腹水型肝癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，在各淋巴結(jié)中均可見(jiàn)異型性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移率為100%，但并未造成明顯的相關(guān)器官發(fā)生病變。淋巴結(jié)（^40）淋巴結(jié)(^10)肝臟（^10）腎(^10)【討論】人體內(nèi)對(duì)抗癌細(xì)胞的功能主要由免疫系統(tǒng)承擔(dān)。免疫系統(tǒng)被腫瘤細(xì)胞阻塞，淋巴液就會(huì)向相反的方向流動(dòng)，導(dǎo)致不符合常規(guī)的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。血行轉(zhuǎn)移：血流速度要比淋巴液流動(dòng)快得多，腫瘤細(xì)胞在血管的轉(zhuǎn)移速度快，來(lái)勢(shì)兇猛。腫瘤細(xì)胞侵入血管的途徑有：1、癌細(xì)胞浸潤(rùn)血管壁（通常為小靜脈）；2、通過(guò)血管破口進(jìn)入血流；3、通過(guò)淋巴管進(jìn)入血流：人體所有的血液首先匯集到肺內(nèi)獲得氧氣，故血行轉(zhuǎn)移的癌灶也以肺最多最早，這也是腫瘤病人都要做肺部X線(xiàn)檢查原因。肝臟、腦、椎、體及骨的轉(zhuǎn)移，一般也是血道擴(kuò)散的后果。種植性轉(zhuǎn)移：此種轉(zhuǎn)移方式主要發(fā)生于腹腔，及胸腔，當(dāng)腫瘤突破所在的胸腔器官的最外處一道防線(xiàn)，癌細(xì)胞可從癌體上脫落下來(lái)，撒播到其下方的臟器表面，哪里條件適合就在哪里附著，生長(zhǎng)，繁殖。癌細(xì)胞好比種子，它附著生長(zhǎng)的地方好比土壤，故稱(chēng)之為種植性轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移常伴有腹水或胸水。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，是一系列具有內(nèi)在聯(lián)系的多個(gè)步驟相互作用的結(jié)果，最早是Liotta提出的粘附、降解、移動(dòng)學(xué)說(shuō)，每個(gè)步驟也是有多個(gè)因素的共同參與，因而其具有復(fù)雜性。當(dāng)前確定腫瘤轉(zhuǎn)移主要是依據(jù)常規(guī)病理切片的結(jié)果，但有些患者雖進(jìn)行了根治手術(shù)，且常規(guī)病理切片淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移，但隨后仍出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。所以單純根據(jù)常規(guī)病理切片。來(lái)進(jìn)行預(yù)后的判斷往往欠科學(xué)，因此急需發(fā)展新的手段來(lái)檢測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移。近年來(lái)隨著免疫學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展，為更敏感地檢測(cè)到淋巴道、血道中轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞提供可能。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大多數(shù)腫瘤患者死亡的主要原因,腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及防治已成為當(dāng)今重要的研究課題。Hca-F和Hca-P是一對(duì)高度同源且淋巴道轉(zhuǎn)移能力顯著不同的小鼠腹水型肝癌細(xì)胞,其中Hca-F為高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株,Hca-P為低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到的腫瘤細(xì)胞的異型性準(zhǔn)要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1．腫瘤細(xì)胞的多形性表現(xiàn)為瘤細(xì)胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，甚至出現(xiàn)胞體特大的瘤巨細(xì)胞。少數(shù)分化差的腫瘤細(xì)胞較相應(yīng)組織的正常細(xì)胞小，圓形，且大小較一致。2．核的多形性細(xì)胞核大小不一，形態(tài)不規(guī)則，甚至出現(xiàn)多核、巨核、畸形核瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞核明顯增大，因而使核/漿比例增大，從正常的1:4～6增至1:1.5～2,甚至1:1。核染色質(zhì)呈粗大顆粒狀，分布不勻，?？拷四し植?，使核膜顯得增厚。核仁肥大,數(shù)目增多。核分裂像多見(jiàn)，并可出現(xiàn)病理性核分裂，即多極性、不對(duì)稱(chēng)性