生物樣品預處理

生物樣品預處理.第一頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第1頁，共41頁。常用的處理方法

處理方法簡介

4生物樣品預處理的目的

1預處理的指導原則23目錄第二頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第2頁，共41頁。一、生物樣品

生物樣品的種類膽汁、乳汁、腦脊液、淚液、精液、胃液、胰液、淋巴液、糞便等。第三頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第3頁，共41頁。一、生物樣品預處理的目的1.使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放出來，以測定藥物的總濃度。2.生物樣品介質(zhì)組成復雜，干擾多，而藥物組分是微量的，必須先經(jīng)過預處理，使純化，富集。3.為了適應和符合測定方法所要求的靈敏度。4.為了防止分析儀器的污染、劣化，提高測定靈敏度、準確度、精密度和選擇性等。第四頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第4頁，共41頁。二、生物樣品預處理的指導原則生物樣品進行預處理時應考慮到的問題：1.藥物的理化性質(zhì)和存在性質(zhì)2.待測藥物的濃度3.藥物測定的目的4.選用的生物樣品類型5.樣品預處理與分析技術(shù)的關(guān)系第五頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第5頁，共41頁。二、指導原則-預處理應考慮問題1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式

A.酸堿性質(zhì)、未電離分子的親脂性、揮發(fā)性：涉及藥物的提取性質(zhì)、是否揮發(fā)損失以及能否采用GC法a.較親脂的藥物：可用溶劑萃取，也可用烷基鍵和相硅膠、大孔吸附樹脂及親水型填料SPE等方法。

b.親水性較強且有酸堿性、可電離藥物：離子交換柱和離子對液液萃取等。c.親水性較強但不能電離藥物：沉淀蛋白第六頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第6頁，共41頁。二、指導原則-預處理應考慮問題1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式

B.藥物在體內(nèi)的存在形式及蛋白結(jié)合率：

a.結(jié)合蛋白率高:

首先去蛋白

b.多為代謝綴合物：綴合物水解

C.藥物的光譜特性及官能團特性：涉及分析儀器的選擇以及是否需要衍生化和特殊檢測器。

紫外吸收強弱：是否用UV檢測器

含有-NO2、-Cl等電負性基團：ECD檢測器第七頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第7頁，共41頁。二、指導原則-預處理應考慮問題1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式D.藥物的穩(wěn)定性：

a.易氧化藥物:加入抗氧劑b.易被光分解藥物:避光

c.易被酯酶水解藥物:對酶進行滅活第八頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第8頁，共41頁。二、指導原則-預處理應考慮問題

2.待測藥物的濃度濃度越大，預處理要求越低；反之，濃度越小，預處理要求越高。例如，地高辛的治療血藥濃度為1-2ng/ml,而水楊酸的治療血藥濃度為20-100μg/ml。3.藥物測定的目的

a.急性中毒病例：快速鑒定所懷疑的藥物，盡可能短時間測得。預處理可粗放些。

b.分別獲得酸性、中性或堿性代謝物：要考慮全面、細致第九頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第9頁，共41頁。二、指導原則-預處理應考慮問題

4.選用的生物樣品類型血漿、血清：除蛋白然后提取唾液：離心去粘蛋白尿液：酸水解或酶水解法使綴合物水解頭發(fā)：有機破壞

5.樣品預處理與分析技術(shù)的關(guān)系樣品預處理需要的凈化程度與所用分析方法是否專屬、是否具有分離能力、檢測系統(tǒng)對雜質(zhì)污染的耐受程度有關(guān)。第十頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第10頁，共41頁。三、常用的處理方法常用方法1.有機破壞法2.除蛋白法3.綴合物的水解4.分離，純化與濃集5.衍生化法重點介紹除蛋白法液液萃取法第十一頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第11頁，共41頁。三、常用的處理方法-有機破壞法1.有機破壞法

分類特點樣品濕法破壞硝酸—高氯酸法

1、硫酸作為分解劑（消化劑），加氧化劑（硝酸、高氯酸、過氧化氫等）作輔助分解劑。2、破壞能力強，反應比較激烈，操作時，應在通風櫥內(nèi)進行。3、先低溫反應，再高溫蒸發(fā)，以免發(fā)生爆炸；4、所得的無機金屬離子，一般為高價態(tài)。血、尿、組織電熱消化器法人發(fā)電熱板消化法烘箱消化法干法破壞高溫熾灼法

1、適用于鹵素、硒、硫、磷等微量元素分析的前處理2、高溫熾灼法：坩堝，先完全炭化，再灰化，鹽酸溶解定容。鹽酸加無水碳酸鈉或氧化鎂等以助灰化。（高溫電子爐、低溫等離子）3、氧瓶燃燒法：密閉的燃燒瓶中進行燃燒，選擇適當吸收液。氧瓶燃燒法血、人發(fā)第十二頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第12頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法蛋白質(zhì)沉淀酶解法去除蛋白第十三頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第13頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法1.蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)，變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定的條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。表面水化層調(diào)節(jié)pH至等電點蛋白質(zhì)親水膠體顆粒凝集析出表面電荷加入脫水劑破壞破壞第十四頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第14頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法

測定血樣時，首先應去除蛋白質(zhì)。去除蛋白質(zhì)作用：

a.可使結(jié)合型藥物釋放出來，以便測定藥物的總濃度；

b.可預防提取過程中蛋白質(zhì)發(fā)泡，減少乳化的形成；

c.可保護儀器性能（如保護HPLC柱不被污染），延長使用期限。

第十五頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第15頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法1.蛋白質(zhì)沉淀方法溶劑解法鹽析和脫水加入中性鹽蛋白質(zhì)沉淀

加入強酸生成不溶性鹽沉淀

加入重金屬沉淀劑第十六頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第16頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法A.溶劑解法-加入與水相混溶的有機溶劑

加入水溶性的有機溶劑，可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物釋放出來。

常用的水溶性有機溶劑有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等。含藥物的血漿或血清與水溶性有機溶劑的體積比為1：（1～3）時，就可以將90％以上的蛋白質(zhì)除去。水溶性有機溶劑的種類不同時，析出的蛋白質(zhì)形狀亦不同；并且所得上清液的pH值也稍有差別，如用乙腈或甲醇時，上清液pH為8.5～9.5，用乙醇或丙酮時，上清液pH為9～10。第十七頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第17頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法A.溶劑解法-加入與水相混溶的有機溶劑操作步驟：

a.水溶性有機溶劑與血漿或血清按一定比例混合

b.離心分離，采用超速離心機（10000r／min）離心1～2min。（使用具塞塑料尖底管）

c.取上清液作為樣品。

將蛋白質(zhì)粘牢在管底，便于吸取上清液第十八頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第18頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法A.溶劑解法-加入與水相混溶的有機溶劑優(yōu)點：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；3）在生化制備中應用比鹽析法廣泛。缺點：對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進行。總體來說，蛋白質(zhì)和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。

第十九頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第19頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法B.加入中性鹽加入中性鹽，使溶液的離子強度發(fā)生變化。中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。

常用的中性鹽有：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等。

操作：a.按血清與飽和硫酸銨的比例為1：2混合;

b.離心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以上的蛋白質(zhì)。c.得上清液的pH為7.0～7.7。第二十頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第20頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法B.加入中性鹽優(yōu)點:

藥物的回收率高；不引起蛋白質(zhì)變性。注意事項:鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強度，溶液pH值越接近蛋白的等電點，蛋白質(zhì)越容易沉淀。第二十一頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第21頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法C.加入強酸當pH低于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)以陽離子形式存在。此時加入強酸，可與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性鹽而沉淀。

常用的強酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-鎢酸混合液及5％偏磷酸等。第二十二頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第22頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法C.加入強酸操作：

a.含藥物血清與強酸的比例為1：0.6混合;

b.離心〈10000r／min）1～2min(可以除去90％以上的蛋白質(zhì))

c.取上清液作為樣品。優(yōu)點：該方法去蛋白迅速簡單，且而所需樣品量少，組分極少變化。分析：過量的三氯醋酸可經(jīng)煮沸，分解為氯仿和二氧化碳而被除去；也有用乙醚提取過量三氯醋酸的方法。過量的高氯酸可用碳酸鉀、醋酸鉀、氫氧化鈉等中和，然后加乙醇使產(chǎn)生的高氯酸鉀（鈉）沉淀而被除去。偏磷酸及硫酸-鎢酸可用同法除去。因加入了強酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性條件下易分解的藥物不宜用本法除蛋白。第二十三頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第23頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法D.加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑當pH高于蛋白質(zhì)的等電點時，金屬陽離子與蛋白質(zhì)分子中帶負電荷的羧基形成不溶性鹽而沉淀。常用的沉淀劑有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等。離心分離后所得的上清液pH分別為5.7～7.3和6.5～7.5。

優(yōu)點：可將含水體液樣品直接進樣或只經(jīng)簡單去蛋白處理后進樣，簡化操作。第二十四頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第24頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法2.酶解法在測定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物時，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。它不僅可使組織溶解，并可使藥物析出?？莶菥芩厥且环N細菌性堿性蛋白分解酶，可在較寬的pH范圍（PH7.0～11.0）內(nèi)使蛋白質(zhì)的肽鍵降解，在50～60℃具有最大活力。

第二十五頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第25頁，共41頁。三、常用的處理方法-除蛋白法2.酶解法

操作：先將被測組織加Tris-緩沖液pH10.5及酶，60℃培育1h，用玻璃棉過濾，得澄清濾液，即可供藥物提取用。

優(yōu)點：可避免某些藥物在酸及高溫下降解；對與蛋白質(zhì)結(jié)合牢的藥物（如保泰松、苯妥英鈉），可顯著改善回收率；可用有機溶劑直接提取酶解液而無乳化現(xiàn)象生成，當采用HPLC法檢測時，無需再進行過多的凈化操作。

不足：不適用于在堿性下易水解的藥物。第二十六頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第26頁，共41頁。三、常用的處理方法-綴合物的水解綴合物：藥物或其代謝物與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的產(chǎn)物。內(nèi)源性物質(zhì)：a.葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等；b.一些含有羥基，羧基，氨基和巰基的藥物，可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸結(jié)合形成葡萄糖醛酸苷綴合物；c.一些含酚羥基，芳胺及醇類藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸形成硫酸酯綴合物。

第二十七頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第27頁，共41頁。三、常用的處理方法-綴合物的水解特點：多用于尿中藥物或其代謝物；綴合物極性較大，不易被有機溶劑提取。常用方法：a.酸水解：適量鹽酸（條件因藥而異）b.酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或兩者的混合酶，一般控制pH值在4.5～5.5，37℃培育數(shù)小時。第二十八頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第28頁，共41頁。三、常用的處理方法-綴合物的水解特點專屬性強溫和時間長

帶入粘蛋白阻塞色譜柱

費用高

帶入粘蛋白導致乳化

b.酶水解法第二十九頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第29頁，共41頁。四、常用的處理方法-分離、濃集、純化（一）液液萃?。╨iquid-liquidextraction，LLE）是傳統(tǒng)的分離、分析方法，據(jù)檢測靈敏度要求，提取后一般需濃集。傳統(tǒng)濃集方法：a.在末次提取時加入的提取液盡量少，使被測組分提取到小體積溶劑中，然后直接吸出適量供測定。b.揮去提取溶劑法。揮去溶劑時應避免直接加熱，防止被測組分破壞或揮發(fā)損失。揮去提取溶劑的常用方法是直接通入氮氣流吹干；對于易隨氣流揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物，可采用減壓法揮去溶劑。

第三十頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第30頁，共41頁。四、分離、濃集、純化-液液萃取法原理：多數(shù)藥物是親脂性的，在適當?shù)挠袡C溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血液或尿液中含有的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強極性的水溶性雜質(zhì)。因而用有機溶劑提取一次即可除去大部分雜質(zhì)，從大量的樣品中提取藥物經(jīng)濃集后作為分析樣品。第三十一頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第31頁，共41頁。四、分離、濃集、純化-液液萃取法操作：萃取一次，不采用反復萃取的方法。特殊情況（雜質(zhì)不易除去，萃取液難以揮發(fā)干擾測定），用一定pH值的水溶液對含藥有機相進行反萃?。╞ackextraction）萃取率不低于50%即可。萃取前加入等量內(nèi)標。第三十二頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第32頁，共41頁。四、分離、濃集、純化-液液萃取法影響萃取的因素影響萃取的因素：有機溶劑的特性、有機溶劑相與水相的體積及水相的pH值等1.溶劑的選擇與純度要求

a.提取率和選擇性b.操作是否方便。選擇溶劑時應注意以下幾點：①要了解藥物與溶劑的化學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，根據(jù)相似相溶的原理進行選用②要求對藥物的未電離分子可溶，而對電離形式的分子不溶③沸點低，易揮散、濃集④無毒、不易燃燒第三十三頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第33頁，共41頁。四、分離、濃集、純化-液液萃取法影響萃取的因素選擇溶劑時應注意以下幾點：⑤與水不相混溶，如乙醚，萃取后可混入約1.2%的水份，可能帶入一些水溶性雜質(zhì)。乙醚萃取能力強，易于揮散、濃集、為常用萃取溶劑，可采用無水碳酸鈉脫水，減少混入的水溶性雜質(zhì)量⑥不易形成乳化⑦具有較高的化學穩(wěn)定性和惰性⑧不影響紫外檢測第三十四頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第34頁，共41頁。四、分離、濃集、純化-液液萃取法影響萃取的因素提取溶劑：第三十五頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第35頁，共41頁。四、分離、濃集、純化-液液萃取法影響萃取的因素2.有機溶劑相和水相的體積

a.有機相與水相（體液樣品）容積比為1:1或2:1。

b.在實驗中考察有機溶劑的最佳用量。3.水相的pH值

a.一般規(guī)則來說，堿性藥物在堿性pH值，酸性藥物在酸性pH值介質(zhì)下提取；b.生物樣品一般多在堿性下提取；c.一些堿性藥物在堿性pH不穩(wěn)定時，則在近中性pH處用氯仿和異丙醇提??；d.中性藥物在pH7附近提取。第三十六頁，編輯于星期六：二十二點五十七分。第36頁，共41頁。四、分離、濃集、純化-液液萃取法液液萃取法優(yōu)點：操作方便;具有選擇性，藥物能與多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)分離，尤其在