生物技術(shù)實(shí)踐

生物技術(shù)實(shí)踐PAGE1PAGE1生物技術(shù)實(shí)踐發(fā)酵食品加工的基本方法果酒制作①原理：酵母菌在有氧條件下，進(jìn)行有氧呼吸，大量繁殖；在無氧條件下進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生酒精和CO2。②菌種——酵母菌：ⅰ、真核生物（真菌）；ⅱ、異養(yǎng)兼性厭氧；ⅲ、腐生生活，屬于分解者；ⅳ、在營養(yǎng)條件良好時(shí)行出芽生殖，在不良條件可以進(jìn)行有性生殖；20℃左右最適合酵母菌繁殖（酒精發(fā)酵時(shí)一般將溫度控制在18～25℃）；ⅴ、生活環(huán)境：含糖較高的偏酸③菌種來源：傳統(tǒng)發(fā)酵使用的酵母菌主要來源于附著在葡萄皮上的野生型酵母菌；工業(yè)生產(chǎn)中為更好地抑制其它微生物的生長、提高果酒品質(zhì)一般使用人工培養(yǎng)的菌種。④果酒制作過程：挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→果酒▲裝瓶：加入的葡萄汁量不超過發(fā)酵瓶容積的2/3?！乐闺s菌污染：葡萄應(yīng)沖冼后去枝梗；榨汁機(jī)用溫水清洗、晾干；發(fā)酵瓶要清洗干凈后，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒；注意排氣時(shí)只需擰松瓶蓋，不要完全揭開瓶蓋，避免空氣中微生物進(jìn)入發(fā)酵液等?！皶r(shí)排氣：由于酒精發(fā)酵過程會(huì)不斷產(chǎn)生CO2，導(dǎo)致發(fā)酵瓶內(nèi)壓力增大▲發(fā)酵條件的控制：溫度嚴(yán)格控制在18～25℃，時(shí)間在10～12天左右。▲發(fā)酵過程中的變化：ⅰ、有機(jī)物總量減少、種類小分子有機(jī)物（如氨基酸等）增多；ⅱ、發(fā)酵液密度減?。òl(fā)酵過程中有CO2放出，溶液中物質(zhì)總質(zhì)量減少）；ⅲ、發(fā)酵液中不斷有氣泡（CO2）產(chǎn)生，pH減??；ⅳ、酒精含量增加；ⅴ、酵母菌數(shù)量出現(xiàn)增長→穩(wěn)定→衰亡特征?！凭臋z測原理：酒精遇酸性重鉻酸鉀反應(yīng)出現(xiàn)灰綠色生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第1頁。方法：2mL發(fā)酵液＋3滴3mol/LH2SO4（振蕩后），＋常溫下飽和的3滴重鉻酸鉀溶液（振蕩觀察）。對照組方法以等量培養(yǎng)液代替發(fā)酵液，其它與實(shí)驗(yàn)組相同。（注意：先加酸，振蕩后再加高錳酸鉀?。┥锛夹g(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第1頁。果醋的制作①果醋制作原理：醋酸桿菌在有氧條件下利用糖或乙醇氧化成醋酸。②總公式：ⅰ、在氧氣、糖源都充足時(shí)：C6C6H12O6＋2O22CH3COOH＋2CO2＋2H2O＋能量酶ⅱ、當(dāng)缺少糖源時(shí)：CC2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O＋能量酶③菌種——醋酸桿菌：ⅰ、原核生物；ⅱ、分裂生殖；ⅲ、異養(yǎng)需氧型，對O2特別敏感，短暫缺氧可能導(dǎo)致醋酸桿菌的死亡，因此，發(fā)酵過程中要特別注意通氣；ⅴ、菌種來源：傳統(tǒng)發(fā)酵來自于變酸的酒表面菌膜。④果醋制作過程：挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→果醋▲氧氣控制：（先密閉制酒，）后通氣制醋。▲制酒菌種：傳統(tǒng)上來自附著在葡萄外的野生型酵母菌；▲發(fā)酵條件：制酒階段：18～25℃，10～12d；制醋階段：通氣，30～35腐乳的制作①腐乳制作的原理：毛霉等微生物產(chǎn)生的以蛋白酶為主的各種酶能將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸，脂肪酸與醇類作用生成酯。②主要菌種：毛霉（此外酵母、青霉、曲霉等）毛霉結(jié)構(gòu)：絲狀真菌，它的菌絲可分為直立菌絲和匍匐菌絲，其中構(gòu)成腐乳“體”的主要是匍匐菌絲。ⅱ、生殖：孢子生殖；ⅲ、代謝類型：異養(yǎng)需氧型；ⅳ、毛霉在腐乳制作中的作用：在豆腐的發(fā)酵過程中，毛霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶能將豆腐的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸。ⅴ、腐乳的生產(chǎn)中毛霉來源：傳統(tǒng)生產(chǎn)中來自于空氣中的毛霉孢子，而現(xiàn)代的腐乳生產(chǎn)是在無菌條件下，將優(yōu)良毛霉菌種直接接種在豆腐上，這樣可以避免其他菌種的污染，保證產(chǎn)品質(zhì)量。③腐乳制作實(shí)驗(yàn)過程：讓豆腐上長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制豆腐含水量：70％左右，水分過多則腐乳不易成形。生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第2頁。長毛霉的條件：15～18℃，大約5天后豆腐表面叢生直立菌絲，當(dāng)毛霉生長旺盛并呈淡黃色。生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第2頁。加鹽：豆腐塊與鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為5：1，分層加鹽，并隨層加高而增加鹽量，在瓶口表面鋪鹽厚些，以防止雜菌從瓶口進(jìn)入。加鹽的作用：a.調(diào)味；b.抑制微生物生長，避免豆腐變質(zhì)；c.浸提蛋白酶等，有利于后期腐乳的成熟。加酒：酒精含量控制在12％左右為宜，酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。④影響腐乳品質(zhì)的主要因素：菌種和雜菌：菌種是生產(chǎn)發(fā)酵的關(guān)鍵，如果菌種退化則表現(xiàn)出生化功能的變化，如水解速率、代謝產(chǎn)物等都會(huì)發(fā)生變化，從而影響品質(zhì)。如有雜菌污染則直接影響產(chǎn)品的色、香、味。發(fā)酵及后成熟的溫度：溫度影響菌絲的生長和代謝，如溫度過低，則菌絲生長緩慢，不能進(jìn)入豆腐塊的深層；溫度高，菌絲易老化和死亡，影響品質(zhì)；溫度還影響生化反應(yīng)速度。發(fā)酵時(shí)間：發(fā)酵時(shí)間影響生化反應(yīng)度及生化產(chǎn)物的量。調(diào)味品：加入的各種酒類、糖類等輔料的多少也對口感有重要影響。微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)Ⅰ培養(yǎng)基（1）分類：按物理性質(zhì)分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。（2）成分：一般都含有水，碳源，氮源和無機(jī)鹽，除此之外，培養(yǎng)基還需要滿足微生物聲場對PH，特殊營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的要求，如在培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，需要在培養(yǎng)基中添加維生素。Ⅱ無菌技術(shù)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵，重點(diǎn)是：消毒常用方法：煮沸消毒，巴氏消毒和化學(xué)藥劑消毒等。滅菌實(shí)驗(yàn)室常用方法：灼燒滅菌，干熱滅菌，高壓蒸汽滅菌。Ⅲ制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：計(jì)算→稱量→溶化→滅菌→倒平板Ⅳ純化大腸桿菌常用的微生物接種的方法有平板劃線法和稀釋平板法。生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第3頁。附：培養(yǎng)基的分類和應(yīng)用生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第3頁。劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途物理性質(zhì)液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)半固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂觀察微生物的運(yùn)動(dòng)，分類和鑒定固體培養(yǎng)基微生物分離，鑒定，活菌計(jì)數(shù)根據(jù)用途選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入了抑制或促進(jìn)微生物生長的化學(xué)物質(zhì)培養(yǎng)，分離出特定微生物鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品鑒別不同種類的微生物酶的應(yīng)用4.探討加酶洗衣粉的洗滌效果酶種類：堿性蛋白酶、堿性脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶，目前洗衣粉中主要加入的是堿性蛋白酶、堿性脂酶等復(fù)合酶。加酶洗衣粉中的酶活性容易受溫度、酸堿度和表面活性劑的影響。保護(hù)加酶洗衣粉中酶活性的方法：ⅰ、科學(xué)家通過基因工程生產(chǎn)出耐酸堿、較能耐受表面活性劑、能耐受較高溫度的酶；ⅱ、通過特殊化學(xué)物質(zhì)將酶包裹，與洗衣粉的其他成分隔離。合理設(shè)置探究溫度對加酶洗衣粉洗滌效果的影響：根據(jù)一年中的實(shí)際氣溫變化來確定水溫，這既是確定實(shí)驗(yàn)變量的基本原則，溫度范圍一般為5～35℃（不低于0℃、高于45使用加酶洗衣粉時(shí)必須注意以下幾點(diǎn)：ⅰ、堿性蛋白酶能使蛋白質(zhì)水解，因此，蛋白質(zhì)類纖維（羊毛、蠶絲等）織物就不能用加酶洗衣粉來洗滌，以免使纖維受到破壞；（2）使用加酶洗衣粉時(shí)，必須注意洗滌用水的溫度。堿性蛋白酶在35℃～50℃時(shí)活性最強(qiáng)，在低溫下或70℃以上就會(huì)失效；（3）加酶洗衣粉也不宜長期存放，存放時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致酶活力損失；（4）加酶洗衣粉不宜與三聚磷酸鹽共存，否則酶的活性將會(huì)喪失；（5）添加了堿性蛋白酶的洗衣粉可以分解人體皮膚表面蛋白質(zhì)，而使人患過敏性皮炎、濕疹等，因此，應(yīng)避免與這類洗衣粉長時(shí)間地接觸。5.酵母細(xì)胞的固定化直接使用酶、固定化酶和固定化細(xì)胞催化的優(yōu)缺點(diǎn)：類型優(yōu)點(diǎn)不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等。①對環(huán)境條件非常敏感，容易失活；②酶難回收，提高了生產(chǎn)成本；③酶與產(chǎn)物混合，不易分離，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。固定化酶①酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離，②可以被反復(fù)利用一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)固定化細(xì)胞成本低，操作更容易固定后的細(xì)胞與反應(yīng)物不容易接近，可能導(dǎo)致反應(yīng)效果下降生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第4頁。固定化酶或細(xì)胞的方法：包埋法、化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法。由于細(xì)胞個(gè)體大難吸附或結(jié)合，而酶分子小容易從包埋材料中漏出，因此，酶更適用于化學(xué)結(jié)合和物理吸附法，細(xì)胞固定多采用包埋法。生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第4頁。酵母細(xì)胞固定化過程：步驟主要操作注意事項(xiàng)酵母細(xì)胞的活化干酵母＋蒸餾水，攪勻后放置1h左右活化時(shí)間充足，以恢復(fù)酵母細(xì)胞的生活狀態(tài)配制CaCl2溶液濃度0.05mol/LCaCl2配制海藻酸鈉溶液稱取0.7g海藻酸鈉＋50mL蒸餾水→加熱溶解海藻酸鈉用小火加熱或間斷加熱，邊加熱、邊攪拌，防止海藻酸鈉焦糊海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合將溶好并冷卻至室溫的海藻酸鈉加入已活化的酵母細(xì)胞，攪拌，使其混合均勻海藻酸鈉應(yīng)冷卻至室溫，防止高溫影響酵母菌的活性；充分?jǐn)嚢?，使酵母?xì)胞分布均勻固定化酵母細(xì)胞恒速、緩慢地將注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液，凝膠珠在CaCl2溶液浸泡30min左右控制注射器擠壓速度、注射器與CaCl2溶液的距離，使凝膠珠呈球形或橢球形用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵用蒸餾水沖洗固定好的酵母細(xì)胞凝膠珠2～3次→加150mL10%葡萄糖溶液，密封，25℃下發(fā)酵24h。觀察發(fā)酵液是否有氣泡，能不能聞到酒味實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價(jià)：ⅰ、加熱使海藻酸鈉溶化是操作中最重要的一環(huán)，涉及到實(shí)驗(yàn)的成敗。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少。ⅱ、檢驗(yàn)?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格：一是用鑷子夾起一個(gè)凝膠珠放在實(shí)驗(yàn)桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實(shí)驗(yàn)桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。ⅲ、凝膠珠顏色和形狀：如果凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高。蛋白質(zhì)，DNA的提取和分離6.DNA粗提取和鑒定DNA粗提取的原理：ⅰ、在0.14mol/LNaCl溶液中DNA溶解度最小，當(dāng)濃度高于或低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度均會(huì)增加，；ⅱ、DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)則溶于酒精，利用這一原理可以將DNA與結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離；ⅲ、蛋白酶能水解蛋白質(zhì)但對DNA沒有影響；ⅳ、大多數(shù)蛋白質(zhì)不能耐受60～80℃的高溫，而DNA在80℃DNA鑒定的原理：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)染成藍(lán)色；注意：ⅰ、二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用；ⅱ設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)（向5mL的2mol/LNaCl溶液中加入4mL二苯胺試劑，混勻后，沸水?。?。以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提?。孩?、本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因：一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長。生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第5頁。ⅱ、主要實(shí)驗(yàn)步驟：生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第5頁。步驟主要操作原理注意事項(xiàng)破碎細(xì)胞釋放DNA加入蒸餾水→攪拌→3～4層紗布過濾，取濾液雞血細(xì)胞滲透吸水沿一個(gè)方向快速攪拌，但不能太快太猛，防止打碎DNA。溶解細(xì)胞核內(nèi)DNA加入兩倍體積的濃度為2mol/LNaCl溶液DNA能溶解于2mol/LNaCl溶液注意應(yīng)沿一個(gè)方向攪拌，使DNA充分溶解析出DNA加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出DNA在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最小緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向不停地均勻攪拌；注意控制加水量DNA的初步純化DNA黏稠物再溶解（加2mol/LNaCl溶液）→加95％的乙醇→攪拌DNA不溶于酒精沿同一個(gè)方向緩慢、均勻地?cái)嚢?，減少DNA斷裂④以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取：ⅰ、研磨時(shí)加入洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑，目的是使植物細(xì)胞膜破碎，釋放DNA；ⅱ、加鹽的目的是溶解細(xì)胞核內(nèi)DNA⑤課題成果評價(jià)：提取的DNA不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多；ⅱ、二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備。本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較方法，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺顯色的深淺等。7.血紅蛋白的提取和分離凝膠色譜法原理：是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快，先流出凝膠柱；反之，則慢，后流出。透析原理：電泳原理：利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等，在某個(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電。SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于測定的蛋白質(zhì)分子量或鑒定蛋白質(zhì)樣品的純度。實(shí)驗(yàn)中通常選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白與樣品同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測出未知蛋白的分子量。緩沖液的作用：維持反應(yīng)體系的pH不變血紅蛋白提取和分離的程序：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定，其中，樣品的處理包括洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，樣品的粗分離方法是經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)；樣品的純化方法是通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去；純度鑒定利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行的。與“血紅蛋白的提取和分離操作”有關(guān)的問題：生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第6頁。材料選擇：血紅蛋白呈紅色，在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷收集洗脫液的時(shí)間，使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。哺乳動(dòng)物血紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白含量豐富，且與鳥類等其它動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)其它蛋白質(zhì)、DNA少，因此容易提純血紅蛋白。生物技術(shù)實(shí)踐全文共7頁，當(dāng)前為第6頁。紅細(xì)胞洗滌