基因克隆及蛋白表達(dá)

關(guān)于基因克隆及蛋白表達(dá)第1頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月研究某一目的基因功能一般策略

目的DNA獲得來自三條途徑:1.

genome上的特定區(qū)域或序列2.

含有目的DNA的質(zhì)粒3.

從cDNA文庫中擴(kuò)增單個(gè)已知cDNA獲得目的DNA構(gòu)建含目的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌蛋白表達(dá)純化轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞蛋白定位、表達(dá)及表型變化第2頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第一部分PCR第3頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)是20世紀(jì)80年代后期由K.Mullis等建立的一種體外酶促擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù)。PCR是利用針對目的基因所設(shè)計(jì)的一對特異寡核苷酸引物，以目的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行的DNA體外合成反應(yīng)。PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡便等特點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。第4頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月一、PCR實(shí)驗(yàn)原理第5頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月一、PCR實(shí)驗(yàn)原理第6頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月二、PCR的反應(yīng)體系

1.PCR引物（1）

primer長度：18-30bp

引物短特異性降低引物長影響產(chǎn)物生成（2）

primer濃度：0.1-1.0umol/L

濃度過高錯(cuò)配、引物二聚體增加濃度過低PCR效率降低第7頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月二、PCR的反應(yīng)體系

2.緩沖液

KCl、Tris-Cl、MgCl2

，

Mg2+：1.5～2.0mM

Mg2+

:

DNA聚合酶活性

PCR產(chǎn)量

Mg2+:PCR反應(yīng)特異性第8頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月二、PCR的反應(yīng)體系

3.DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶

LADNA聚合酶

PrimeSTAR(PyrobestDNA聚合酶

)

PfuDNA聚合酶第9頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月TaqDNApolymerase5‘5‘3‘3‘5‘3‘3‘5‘5’3’DNA聚合酶活性。在模板和引物存在的條件下，以dNTP作為底物，沿5’3’方向合成與模板互補(bǔ)的DNA第12頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月LATaqDNAPolymerase1.5’3’DNA聚合酶活性；2.3’5’DNA外切酶活性。第13頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月Pyrobest&pfuDNAPolymerase

TaqDNA聚合酶活性

3’5’外切酶活性，可信度極高

PCR產(chǎn)物為平滑末端第14頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的反應(yīng)體系4．dNTP:

50-200umol/L5.模板DNA（1）

單鏈DNA（2）

雙鏈DNA（3）

濃度：基因組DNA：1ug

質(zhì)粒DNA：10ng

第15頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月三、基本操作步驟1.

變性(denature):95℃高溫下,雙螺旋氫鍵斷裂,雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA2.

退火(annealing):兩條引物與模板DNA擴(kuò)增區(qū)域的兩端按堿基互補(bǔ)配對結(jié)合.3.

延伸(extension):在4種dNTP底物及Mg2+存在條件下,TaqDNA聚合酶在72℃下,將單核苷酸按堿基互補(bǔ)配對原則從引物3‘端摻入,,使引物沿5’→3’方向延伸合成新股DNA第16頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月四、條件優(yōu)化1.

變性:95℃變性20-30s,即可使各種DNA完全變性。2.

退火:引物與模板退火溫度由引物長度和GC%決定,退火溫度一般應(yīng)比Tm值低4-12℃為宜,退火時(shí)間一般為20-40s。3.

延伸:通常68-75℃。延伸時(shí)間取決于擴(kuò)增片斷的長度.可以500bp/30s為基準(zhǔn)，根據(jù)目的片斷的長度計(jì)算反應(yīng)時(shí)間。4.

循環(huán)次數(shù)：一般為25-35次。第17頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)液PCRBuffer（Mg2+）2.5μldNTP混合物（各2.5mM）4μl模板DNA1μl引物1（20uM）0.5μl引物2（20uM）0.5μlTaqDNApolymerase（5U/ul）0.25μlddH2O至25μl第18頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)條件94℃5min94℃30sec55℃30sec30Cycles72℃1min72℃10min4℃forever第19頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月五、PCR引物的設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)成功的一個(gè)關(guān)鍵條件是正確設(shè)計(jì)引物PCR引物設(shè)計(jì)目的是在擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率兩個(gè)目標(biāo)上取得平衡.可以利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物設(shè)計(jì)軟件會通過每一引物設(shè)計(jì)變化的預(yù)定值在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡,找出最佳引物.有時(shí)也需根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整.第20頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的基本原則

(一)引物長度在16-30bp范圍內(nèi),以18-24bp為最佳.引物過短,產(chǎn)物特異性降低,每增加一個(gè)核苷酸,引物特異性可增加4倍.引物的長度是指與模板DNA序列互補(bǔ)的部分,不包括為后續(xù)克隆而加的酶切位點(diǎn)與額外序列.第21頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的基本原則(二)引物末端1.引物的3’末端對于PCR反應(yīng)是關(guān)鍵.2.引物的3’末端的第一和第二個(gè)堿基影響TaqDNA聚合酶的延伸效率,故其影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率及特異性.引物3’末端最佳堿基選擇G或C，因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對比較穩(wěn)定。第22頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的基本原則3.引物5’末端的堿基無嚴(yán)格限制當(dāng)引物的長度足夠時(shí),引物5’末端的堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)?？稍?’端加上限制內(nèi)切酶位點(diǎn),啟動子序列或其他序列等,以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆。第23頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的基本原則4.在一個(gè)PCR反應(yīng)中的一對引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,特別是3’末端應(yīng)盡量避免互補(bǔ),以免形成“引物二聚體”造成引物浪費(fèi)和非特異性的擴(kuò)增.5.每個(gè)引物的內(nèi)部應(yīng)盡量避免形成二級結(jié)構(gòu),特別是引物的末端應(yīng)無回文結(jié)構(gòu).第24頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的基本原則(三)引物的GC含量和Tm值PCR引物G+C堿基的含量應(yīng)保持在45-65%之間，G+C含量一般為40-60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5-10度。引物長度小于20bp時(shí),Tm=4(G+C)+2(A+T)

。第25頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的基本原則(四)引物的位置1.引物的序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列，這樣可減少引物與基因組的非特異結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性。2.若以cDNA為模板，則首先應(yīng)盡量使引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)；其次，盡量把引物放在不同的外顯子上，以便使特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。第26頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的基本原則（五)Primerprimer5.0輔助的引物設(shè)計(jì)步驟及條件優(yōu)化第27頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第二部分RT-PCR第28頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月RT-PCR是將RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR結(jié)合起來建立的一種PCR技術(shù)。首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，然后進(jìn)行常規(guī)PCR。第29頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月cDNA合成

Superscriptfirst-strandsynthesissystemforRT-PCR是從總RNA或mRNA合成cDNA。RNA量為1ng~5ug。第30頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月ReverseTranscriptase5‘5‘3‘3‘5‘3‘3‘5‘1.依賴于RNA的5’3’DNA聚合酶活性（反轉(zhuǎn)錄活性）；2.依賴于DNA的5’3’DNA聚合酶活性。第31頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月ReverseTranscriptaseRNADNADNA3.RNaseH活性：特異性識別并分解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈第32頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月RT-PCR第33頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成

RNaseH缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MuLV）反轉(zhuǎn)錄酶是一種RNA介導(dǎo)的DNA聚合酶。該酶能以RNA或者單鏈DNA做模板由引物起始合成一個(gè)互補(bǔ)的DNA鏈。RNaseH活性的缺失增強(qiáng)了該酶合成長鏈cDNA的能力。

編碼M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶的基因在重組大腸桿菌中表達(dá)，該酶在其RNaseH區(qū)域含一點(diǎn)突變，從而使修飾后酶的RNase活性缺失，但反轉(zhuǎn)錄功能不受影響。第34頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成

進(jìn)行PCR前用RnaseH消化。去除與cDNA結(jié)合的RNA，增加PCR敏感性。第一鏈合成過程中RNaseH降解模板mRNA，導(dǎo)致全長cDNA合成減少及cDNA第一鏈產(chǎn)量降低。第35頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月cDNA第一鏈的合成有三個(gè)方法

（1）

Randomhexamers：是最非特異性引物。通常在特異全長mRNA難以拷貝時(shí)應(yīng)用此引物。利用該方法，以全部RNA做模板合成cDNA。在PCR時(shí)，PCR引物決定其特異性。第36頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月cDNA第一鏈的合成有三個(gè)方法（2）oligo（dT）：較特異和常見的方法,其cDNA的合成數(shù)量和復(fù)雜性大大低于randomhexamers方法,尤其是進(jìn)行新的mRNART-PCR時(shí),建議用此方法.第37頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月cDNA第一鏈的合成有三個(gè)方法(3)Gene-specificprimer(GSP):最為特異的方法。利用鄰近mRNA3’末端的PCR引物進(jìn)行cDNA第一鏈合成,但是,某些GSP即使以DNA為模板,能擴(kuò)增出DNA條帶.有時(shí),也不能進(jìn)行cDNA第一條鏈合成.此時(shí)建議用oligo（dT）引物.第38頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月cDNA第一條鏈合成步驟第39頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第40頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第三部分克隆第41頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA提取純化RT-PCR質(zhì)粒DNAPCR凝膠回收PCR擴(kuò)增片段目的基因片段T-A克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞藍(lán)白斑篩選質(zhì)粒提取、酶切鑒定連入GST融合表達(dá)載體外源基因克隆到真核表達(dá)載體GST融合蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)化、活性測定轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞表達(dá)定位得到目的基因片段的T-A克隆第42頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR片段回收利用從瓊脂糖凝膠中回收純化DNA片段的試劑盒。試劑盒采用了獨(dú)特的凝膠融解系統(tǒng)，結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有高效快速的特點(diǎn)。本試劑盒純化DNA片段純度高，完整性好。可直接用于連接反應(yīng)，PCR擴(kuò)增。

第43頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月T-A克隆經(jīng)TaqDNA聚合酶擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個(gè)A。正是基于這一原理，pGEM-T質(zhì)粒經(jīng)EcoRV切成平端后，在開口端加上一個(gè)T制成T載體，一方面避免了自身環(huán)化，另一方面由于T-A互補(bǔ)，提高了T載體與PCR產(chǎn)物之間的連接效率。

第45頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第46頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月T-Vector第48頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞：限制修飾酶系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體（Rˉ，Mˉ）。它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2）處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞（Competentcells）。第49頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（Transformant），即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。

第50頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月T-Vector第51頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月進(jìn)行藍(lán)白篩選，對陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增

IPTG(異丙基-β-半乳糖苷）是β-半乳糖苷酶活性的誘導(dǎo)物,可使lacZ阻抑物失活，從而誘導(dǎo)lac操縱子轉(zhuǎn)錄?；谶@個(gè)特性,當(dāng)PUC系列載體以lacZ缺欠細(xì)胞作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí),如果在培養(yǎng)基中加入X-Gal和IPTG,由于β-半乳糖苷酶的α-互補(bǔ)性,可以根據(jù)是否呈現(xiàn)白色而方便的選擇出基因重組體.第52頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月進(jìn)行藍(lán)白篩選，對陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增

X-gal:(5-溴-4氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)X-gal是E.Coli產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的顯色底物。β-半乳糖苷酶可將X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘纳钏{(lán)色沉淀。第53頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月進(jìn)行藍(lán)白篩選，對陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增

雙鏈pGEM-T質(zhì)粒，有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)處于表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因突變的大腸桿菌株（JM109或DH5α）時(shí)，因?yàn)橛少|(zhì)粒表達(dá)的α-肽補(bǔ)充了大腸桿菌缺失的α-肽，所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。第54頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月進(jìn)行藍(lán)白篩選，對陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增

在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，長出藍(lán)色克隆。如果在多克隆位點(diǎn)內(nèi)插入外源DNA，由于它破壞了α-肽的表達(dá)，因而在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基，不能長出藍(lán)色克隆，這就是所謂的藍(lán)白篩選。第55頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的提取及酶切鑒定第56頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第57頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第四部分：外源基因的原核表達(dá)第58頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月外源基因的原核表達(dá)

外源基因的表達(dá)是研究和探索基因功能、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的重要方法，亦是制備和生產(chǎn)新型蛋白質(zhì)藥物、新型診斷試劑必不可少的手段。外源基因通過在宿主細(xì)胞中的表達(dá)可大量獲得其產(chǎn)物。

第59頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月一、原核表達(dá)系統(tǒng)常用的載體及其應(yīng)用

（一）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

（二）大腸桿菌載體的表達(dá)方式

第60頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清晰、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短等；第61頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

缺點(diǎn)： ①缺少真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工過程，如剪切、糖基化及正確二硫鍵的形成等；②表達(dá)的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在，需經(jīng)復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象與活性；③宿主本身雜蛋白多，純化步驟復(fù)雜。第62頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌載體的表達(dá)方式

1．非融合性表達(dá)載體：此種載體表達(dá)的蛋白質(zhì)與天然狀態(tài)下存在的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、功能和免疫源性等方面基本或完全一致。第63頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌載體的表達(dá)方式

2．融合表達(dá)載體：分子量較小的蛋白質(zhì)可采用這種載體進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)：

①可增加mRNA和表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性； ②可應(yīng)用針對融合蛋白中非目的蛋白片段 進(jìn)行親和層析，很容易將融合蛋白純化； ③通過融合表達(dá)可產(chǎn)生可溶性蛋白；第64頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌載體的表達(dá)方式

融合表達(dá)載體主要有以下幾種：

①谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）系統(tǒng)； ②β-半乳糖苷酶系統(tǒng)； ③麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）系統(tǒng)； ④蛋白A系統(tǒng)； ⑤與純化標(biāo)簽融合表達(dá)以及其他融合系統(tǒng)。第65頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌載體的表達(dá)方式

3．帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體：目前應(yīng)用較多的純化標(biāo)簽有GST-tag,FLAG-tag,His-tag.4．分泌型表達(dá)載體5．表面展示表達(dá)載體6．帶分子伴侶的表達(dá)載體

第66頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月外源基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化第67頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月擴(kuò)增陽性克隆并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)

pGEX-5x-1載體帶有IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)啟動子，可以表達(dá)外源蛋白的總量可以達(dá)到全菌蛋白的30%以上。

第68頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS電泳

將含有目標(biāo)蛋白的樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離。利用濃縮膠和分離膠的濃縮效應(yīng)，電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)對不同分子量大小的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。

第69頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月第70頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月WesternBlotGST-Pro-BGST第71頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA提取純化RT-PCR質(zhì)粒DNAPCR凝膠回收PCR擴(kuò)增片段目的基因片段T-A克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞藍(lán)白斑篩選質(zhì)粒提取、酶切鑒定連入GST融合表達(dá)載體外源基因克隆到真核表達(dá)載體GST融合蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)化、活性測定轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞表達(dá)定位得到目的基因片段的T-A克隆第72頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月Northern印跡雜交是用于檢測和量化細(xì)胞RNA的一種基本技術(shù)。它主要是將電泳凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，通過紫外交聯(lián)作用而使RNA與膜永久的結(jié)合在一起，固定在膜上的RNA樣品與特異的探針雜交，從而對感興趣的RNA進(jìn)行定位。

Northern印跡雜交

第73頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月Northern印跡雜交

一、DNA探針標(biāo)記在核酸分子雜交中，探針是指用放射性核素或其他標(biāo)記物標(biāo)記的核酸片段，它具有特定的序列，能夠和待測的核酸片段互補(bǔ)結(jié)合，因此可用于檢測核酸樣品中的特定基因。第74頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月Northern印跡雜交

一、DNA探針標(biāo)記用于探針標(biāo)記的標(biāo)記物有放射性核素與非放射性核素兩大類，前者是目前最常用的標(biāo)記方式；后者包括生物素、地高辛及熒光素等。第75頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月Northern印跡雜交

一、DNA探針標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記方法：1.切口平移法2.隨機(jī)引物法這是近年來發(fā)展起來的較為理想的核酸探針標(biāo)記方法。第76頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2023年2月Northern印跡雜交

一、DNA探針標(biāo)記第77頁，課件共86頁，創(chuàng)作于2