基因功能研究方法

基因功能研究方法目前一頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)1隨著生物學(xué)研究在分子水平上的不斷深入和推進(jìn)，越來越多的新基因得以成功克隆，對新基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時代功能基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。目前二頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)21.微陣列分析

微陣列(microarray)是近年來發(fā)展起來的可用于大規(guī)?？焖贆z測基因差異表達(dá)、基因組表達(dá)譜、DNA序列多態(tài)性、致病基因或疾病相關(guān)基因的一項(xiàng)研究基因功能的新技術(shù)。它包括cDNA微陣列(cDNAmicroarray)和DNA芯片。目前三頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)3

原理:

將成千上萬條DNA片段(cDNA、表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetag,EST)或特異的寡核苷酸片段)按橫行縱列方式有序點(diǎn)樣在固相支持物上。固相支持物為硝基纖維膜或尼龍膜時稱為微陣列。固相支持物改為指甲蓋大小的玻片或硅片時所形成的微陣列就稱為DNA芯片。目前四頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)4

微陣列法分析過程首先用來自不同生理狀態(tài)和發(fā)育階段的mRNA作為模板,以放射性同位素或熒光標(biāo)記的dNTP為底物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再用所得cDNA與微陣列或DNA芯片進(jìn)行雜交,然后通過計(jì)算機(jī)對結(jié)果進(jìn)行判讀和處理,這樣就可以知道芯片中哪些基因在細(xì)胞里表達(dá),哪些基因不表達(dá);同樣也可以測知哪些基因的表達(dá)水平高,哪些基因的表達(dá)水平低。目前五頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)5

芯片的制作目前常用的基因芯片制作方法：接觸點(diǎn)樣法、噴黑法、原位合成法。接觸點(diǎn)樣法：是將樣品直接點(diǎn)在基體上，其優(yōu)點(diǎn)是儀器結(jié)構(gòu)簡單、容易研制，是一種快速、經(jīng)濟(jì)、多功能的儀器，可以在3.6cm2面積內(nèi)點(diǎn)上10000個cDNA。不足之處是每個樣品都必須合成好、經(jīng)過純化、事先保存的。目前六頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)6噴黑法:是以定量供給的方式，通過壓電晶體或其他推進(jìn)形式從很小的噴嘴內(nèi)把生物樣品噴射到玻璃載體上。同樣需要合成好的純樣品，包括cDNA、染色體DNA片段和抗體。在1cm2面積上可噴射10000個點(diǎn)。目前七頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)7原位合成法：主要是美國Affymetrix公司開發(fā)的寡聚核苷酸原位光刻DNA合成技術(shù)。采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5’羥基末端連上一個光敏保護(hù)基，利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后逐個將5’端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。此方法的優(yōu)點(diǎn)是合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長，在1.6cm2面積上合成40萬組寡核苷酸。目前八頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)8信號檢測與結(jié)果分析激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點(diǎn)的信號軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理目前九頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)9目前十頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)102.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是將目的基因轉(zhuǎn)入某一細(xì)胞中,然后觀察該細(xì)胞生物學(xué)行為的變化,從而了解該基因的功能。這是目前應(yīng)用最多、技術(shù)最成熟的研究基因功能的方法之一。但因基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和是否持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)兩方面因素的影響。主要方法有物理的、化學(xué)的和生物的方法。目前十一頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)11

物理方法1>.DNA直接注射法:是目的基因?qū)氲淖詈唵畏椒?但注入量有限,能夠接觸到的細(xì)胞有限,故獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率很低,多通過腫瘤局部多點(diǎn)注射給藥。

2>.顆粒轟擊技術(shù):將目的基因包被金屬以后,利用高壓發(fā)射裝置,加速包裹目的基因的金屬顆粒進(jìn)入細(xì)胞,從而提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。

目前十二頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)12化學(xué)方法1>.脂質(zhì)體載體：方法具有安全、簡單、低毒、無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，適用于注射方法進(jìn)行器官靶向性轉(zhuǎn)移并有一定的轉(zhuǎn)移效率。是除病毒載體轉(zhuǎn)移方法之外的另一種有價值的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法。

目前十三頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)13目前十四頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)14目前十五頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)15目前十六頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)162>.受體介導(dǎo)法：利用肝細(xì)胞上富含轉(zhuǎn)移因子和糖蛋白受體的特點(diǎn)，人工合成多聚陽離子氨基酸，進(jìn)而連接轉(zhuǎn)移因子(或糖蛋白)和目的基因構(gòu)成復(fù)合物，通過與肝細(xì)胞表面的受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn):靶向性好，但受體介導(dǎo)的內(nèi)吞小泡會被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，易被溶酶體降解而造成目的基因表達(dá)時間短暫，表達(dá)效率低下。利用腺病毒與內(nèi)吞小泡相融合而將其破壞釋放出外源DNA，可提高轉(zhuǎn)化效率。目前十七頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)17生物學(xué)方法(主要通過構(gòu)建病毒載體來完成)病毒表達(dá)載體:以病毒為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)因其轉(zhuǎn)染效率高、目的基因可穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用。1>.逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus，Rv):構(gòu)建簡單，裝載外源基因容量最大達(dá)8kb，整合入宿主細(xì)胞基因組而無病毒蛋白表達(dá)。但僅能感染分裂期細(xì)胞，體外制備滴度較低，且其隨機(jī)整合有引起“插入性突變”的可能。

目前十八頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)182>.腺病毒(adenovirus,Adv):為近年肝細(xì)胞肝癌基因治療中報(bào)告最多的一種病毒載體。裝載外源基因容量最大達(dá)35kb，不整合入宿主細(xì)胞基因組因而避免插入突變的危險(xiǎn)，能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞。但易引起宿主免疫反應(yīng)而使轉(zhuǎn)染效率下降。目前十九頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)19目前二十頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)203.反義技術(shù)反義技術(shù)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理,利用人工或生物合成的特異互補(bǔ)的DNA或RNA片段(或其修飾產(chǎn)物)來抑制或封閉目的基因的表達(dá)。包括反義寡核苷酸技術(shù)(Antisenseoligonuclerotides,ASON)、反義RNA技術(shù)和核酶(Ribozyme)技術(shù)。目前二十一頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)213.1反義寡核苷酸技術(shù)反義核苷酸是一類經(jīng)人工合成或構(gòu)建的反義表達(dá)載體表達(dá)的寡核苷酸片段，長度多為15-30個核苷酸，通過堿基互補(bǔ)原理，干擾基因的解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪接加工乃至輸出和翻譯等各個環(huán)節(jié)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化等。根據(jù)結(jié)合部位的不同分為反義DNA（asDNA）、反義RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribozyme）。目前二十二頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)223.2反義RNA技術(shù)反義RNA技術(shù)是利用基因重組技術(shù),構(gòu)建人工表達(dá)載體,使其離體或體內(nèi)表達(dá)反義RNA,反義RNA能與靶mRNA形成較穩(wěn)定的二聚體,從而抑制靶基因的表達(dá)。其作用機(jī)理可能在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯多水平上抑制靶基因的表達(dá)。目前二十三頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)23

3.3核酶技術(shù)

核酶(Ribozyme)技術(shù)是一類具催化活性的特殊RNA分子,通過堿基配對原則特異性滅活靶RNA分子?？闪呀馀c其互補(bǔ)的mRNA及在DNA內(nèi)插入DNA片段構(gòu)成三鏈結(jié)構(gòu)，單個核酶分子可以結(jié)合多個mRNA分子并使之在特定部位斷裂,而其本身具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu),不易受RNase攻擊,因而催化效率比反義RNA高。常見的核酶有錘頭狀、發(fā)夾狀和斧頭狀三種,應(yīng)用最多的是錘頭狀核酶。目前二十四頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)24最常用的為反義寡脫氧核苷酸（反義寡核苷酸），其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性（堿基互補(bǔ)）、設(shè)計(jì)容易、多樣且合成簡單及高度的局部性和針對性。目前二十五頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)25

反義技術(shù)的兩種技術(shù)路線將表達(dá)與體內(nèi)基因或mRNA互補(bǔ)序列的基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，使細(xì)胞表達(dá)與目標(biāo)基因互補(bǔ)的mRNA失活，從而阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)體外合成mRNA互補(bǔ)的核苷酸類似物，通過靜脈注射等途徑進(jìn)入細(xì)胞，特異性的與目標(biāo)mRNA作用目前二十六頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)26

反義寡聚核苷酸與mRNA特異性結(jié)合，阻斷翻譯過程目前二十七頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)274.基因敲除和敲入4.1基因敲除(Geneknockout)又稱基因打靶(genetargeting),是同源重組技術(shù)的形象說法。通過一定的途徑使特定的基因失活或缺失的技術(shù)。它是指用外源DNA與受體細(xì)胞基因組中順序相同或者非常相近的基因發(fā)生同源重組,整合到受體細(xì)胞基因組中并得到表達(dá)的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù)。目前二十八頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)28優(yōu)點(diǎn)：此技術(shù)整合位點(diǎn)確定、精確,轉(zhuǎn)移基因頻率較高,既可以用正常基因敲除突變的基因,以進(jìn)行性狀的改良和遺傳病的治療;又可以用突變的基因敲除正常的基因,以研究此基因在發(fā)育和調(diào)控方面的作用。目前二十九頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)29目前利用基因敲除得到轉(zhuǎn)基因動物的程序可簡述如下:(1)克隆基因組中某一基因的全部或部分DNA序列,用插入、刪除、置換、修飾等手段重建DNA序列,使之成為靶載體;(2)將靶載體導(dǎo)入小鼠的胚胎干細(xì)胞中,使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組相應(yīng)部分發(fā)生同源重組,將靶載體的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中;目前三十頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)30(3)將胚胎干細(xì)胞受體細(xì)胞注入小鼠的囊胚,將這些囊胚導(dǎo)入假孕母鼠子宮中,產(chǎn)生的雄性嵌合鼠子代與正常的雌鼠交配即可獲得生殖系統(tǒng)攜帶該基因的純合鼠,進(jìn)而分析被剔除基因的功能。目前三十一頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)31目前三十二頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)324.2基因敲入

基因敲除技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能的強(qiáng)有力手段,但對于許多基因來說,簡單的失活常導(dǎo)致令人費(fèi)解的無改變的表型。最常見的解釋是某些其它基因取代了靶基因的功能,但要在普通基因敲除小鼠中證明這一點(diǎn)十分困難?；蚯萌爰赐ㄟ^基因打靶用一種基因替換另一種基因以確定它們是否具有相同功能。目前三十三頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)33

基因敲入的設(shè)計(jì),是一個類似于普通基因敲除法的一步同源重組過程。不同之處在于,設(shè)計(jì)打靶載體時需將靶基因第一個外顯子的N-端序列缺失,并將新的替換基因置于靶基因的調(diào)控序列之下,使其能精確地按照靶基因的調(diào)控模式表達(dá)。此方法不僅能用一種基因置換另一種基因,且可以系統(tǒng)地改變基因的結(jié)構(gòu),分析其蛋白產(chǎn)物各功能區(qū)的作用。目前三十四頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)346.人工染色體的轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是進(jìn)行蛋白功能分析和基因表達(dá)調(diào)控的有力手段,但使用小的質(zhì)粒重組體存在表達(dá)水平低、缺乏組織特異性等缺點(diǎn),若將大的DNA片段克隆入酵母人工染色體(YACs)或細(xì)菌染色體，可產(chǎn)生較好的表達(dá)水平和組織特異性,并可精確地調(diào)節(jié)同源重組。目前三十五頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)35酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。此外，YAC還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn)?？梢越邮?00-1000kb的外源DNA片段。目前三十六頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)36人工酵母染色體就是把酵母染色體上與基因復(fù)制和表達(dá)有關(guān)的主要組件都組裝在質(zhì)粒上，令質(zhì)粒行使酵母的轉(zhuǎn)錄功能和復(fù)制功能。

YACDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法主要有核注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)和酵母原生質(zhì)體融合等。采用YAC轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的方式可使導(dǎo)入基因的水平與內(nèi)源基因相當(dāng),并且具有類似于天然的剪接機(jī)理,適用于復(fù)雜的基因功能分析。目前三十七頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)37目前三十八頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)38酵母人工染色體(適用于克隆大片段DNA，0.2～2Mb。)目前三十九頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)39YAC要具備的主要功能成份

1）著絲粒：mitosis姊妹染色單體和減I同源染色體分離之必需。2）端粒：保護(hù)染色體末端免受核酸酶的侵襲。3）自主復(fù)制序列（ARS）元件：是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。構(gòu)建YAC需要4個短序列：2個端粒，著絲粒，ARS元件，與外源DNA連接成線性DNA分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆。

目前四十頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)407.基因誘捕技術(shù)基因誘捕是通過物理、化學(xué)、生物等方法將一個帶有外源基因如抗藥基因或報(bào)告基因的DNA載體導(dǎo)入到ES細(xì)胞中.外源基因通過捕獲到的內(nèi)源基因表達(dá)調(diào)控元件獲得表達(dá)的同時,使內(nèi)源的基因功能喪失.利用cDNA末端快速擴(kuò)增法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)或者質(zhì)粒拯救法可以獲知外源基因整合位點(diǎn)旁側(cè)的序列.通過顯微注射或ES細(xì)胞融合技術(shù)可以獲得特定基因缺失的動物用于功能研究.目前四十一頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)418.新的晶體解析方法結(jié)合已建立的大規(guī)模蛋白原核分泌表達(dá)與純化技術(shù)系統(tǒng),將對大量新基因編碼蛋白進(jìn)行晶體培養(yǎng)，通過計(jì)算機(jī)分析,以研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因功能的方法。目前四十二頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)42目前已成功制備了耐熱鄰苯二酚2,3-雙加氧酶、耐熱堿性磷酸酯酶的蛋白質(zhì)晶體,并收集了X-衍射數(shù)據(jù).在國內(nèi)首次獲得了硒化耐熱鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的晶體,在日本的同步輻射光源上收集了3個波長的分辨率為2.0的衍射數(shù)據(jù)。另外,耐熱堿性磷酸酯酶的多對同晶置換法的結(jié)構(gòu)解析也在進(jìn)行之中.通過計(jì)算機(jī)分析,對不同來源的木糖異構(gòu)酶的(G+C)%與蛋白質(zhì)耐熱性之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。目前四十三頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)43發(fā)現(xiàn)精氨酸和一些疏水氨基酸的含量與編碼序列的(G+C)%表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性,這個發(fā)現(xiàn)揭示了蛋白熱穩(wěn)定性與DNA熱穩(wěn)定性相一致的內(nèi)在規(guī)律,闡明了高(G+C)%的生物適合于高溫環(huán)境的機(jī)制。目前四十四頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)449基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究細(xì)胞各種基本功能的完成離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。

因此，確定能夠與新基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)終產(chǎn)物相互作用的上下游蛋白質(zhì)分子，也是研究新基因功能的一個十分重要的方面。目前常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)包括傳統(tǒng)的基于親和分析而建立的免疫共沉淀技術(shù)和近年來建立和廣泛應(yīng)用的酵母雙雜交系統(tǒng)等。目前四十五頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)45免疫共沉淀技術(shù)

免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，所處的環(huán)境條件也是接近天然狀態(tài)的，能夠反映體內(nèi)的相互作用情況，也可以分離到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物，但應(yīng)該注意，有時免疫共沉淀的蛋白質(zhì)并非是直接相互作用，而是間接的相互作用，其靈敏度也相對較低。目前四十六頁\總數(shù)五十頁\編于十三點(diǎn)46酵母雙雜交系統(tǒng)酵母