微生物實驗課7

實驗七病毒學(xué)實驗

VIROLOGY目的要求

掌握臨床常規(guī)檢測HBV五項血清標(biāo)志物的意義熟悉常用的病毒培養(yǎng)方法；熟悉病毒包涵體檢測在病毒感染診斷中的意義。熟悉ELISA的原理；病毒特點：1.體積微小，絕大多數(shù)病毒能通過濾菌器，須在電子顯微鏡下才能看到其形態(tài)；2.結(jié)構(gòu)簡單，為非細(xì)胞型微生物，沒有細(xì)胞器，一種病毒只含一種類型的核酸（DNA或RNA）；3.嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，不能在無生命的培養(yǎng)基中生長增殖，必須進(jìn)入合適的活細(xì)胞中依靠活細(xì)胞供給酶系、能量、養(yǎng)料及細(xì)胞器才能增殖。病毒的培養(yǎng)動物接種雞胚培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)1.動物接種最原始的病毒分離方法。在某些對其敏感性強(qiáng)的病毒的分離，或科學(xué)研究需要制作“動物模型”方面，至今仍有其重要性。

缺點：①動物本身可能帶有病毒；

②許多病毒受種屬特異性限制。

選擇易感動物：常用小白鼠、大鼠、豚鼠、家兔及猴

適宜的接種途徑：鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、腹腔或靜脈。

觀察實驗動物發(fā)病、死亡情況。

2.雞胚培養(yǎng)主要優(yōu)點是雞胚來源充分，操作簡便，管理容易，本身帶病毒的情況少見，只要選擇適當(dāng)?shù)慕臃N部位，病毒很容易增殖，目前主要用于痘類病毒、粘病毒、皰疹病毒的分離、鑒定、制備抗原和疫苗的生產(chǎn)等。3.組織細(xì)胞培養(yǎng)適于絕大多數(shù)病毒生長，是病毒實驗室的常規(guī)技術(shù)。優(yōu)點:沒有隱性感染，沒有免疫抵抗力，便于選擇易感細(xì)胞，實驗條件易于控制，成本便宜，經(jīng)濟(jì)適用。細(xì)胞培養(yǎng)的類型來源傳代染色體數(shù)目原代細(xì)胞宿主不超過10代正常二倍體細(xì)胞株胚肺50-100代正常傳代細(xì)胞系二倍體細(xì)胞/惡性組織無限傳代不正常CPE三個類型:全變型：指整個細(xì)胞都發(fā)生改變，表現(xiàn)為細(xì)胞核及整個細(xì)胞都發(fā)生腫脹，胞漿呈顆粒樣變性、胞膜邊緣不整齊；或者整個細(xì)胞發(fā)生碎裂、皺縮、變圓、脫落。包涵體型：有的病毒可在胞核或胞漿內(nèi)形成包涵體。融合型：有的病毒（如麻疹病毒、單純庖疹病毒等）可使多數(shù)病變細(xì)胞間相互發(fā)生融合而呈“多核巨細(xì)胞”（但各個細(xì)胞的胞核仍可分辨）。細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect，CPE）：體外實驗時，病毒感染細(xì)胞后，在光學(xué)顯微鏡下見到細(xì)胞病變作用。未感染病毒的Hela細(xì)胞細(xì)胞變圓，折光度增強(qiáng)，胞漿顆?；?，核固縮，細(xì)胞死亡、脫落。細(xì)胞鋪滿管壁、排列規(guī)則緊密、互相嵌合的多邊形細(xì)胞。感染病毒后的Hela細(xì)胞腺病毒感染上皮細(xì)胞感染前早期感染感染后期slidesfromCDC2.包涵體（inclusionbody）形成

包涵體（inclusionbody):某些病毒感染細(xì)胞后，在普通光學(xué)顯微鏡下，可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性的，圓形、橢圓形或不規(guī)則形的斑塊結(jié)構(gòu)。不同病毒所形成的包涵體特征各異，故有助于病毒感染的輔助診斷。

狂犬病毒內(nèi)基小體（Negribody）3.細(xì)胞融合：某些病毒的酶類或感染細(xì)胞釋放的溶酶體酶，使感染細(xì)胞膜改變，導(dǎo)致感染細(xì)胞與鄰近細(xì)胞融合。是病毒擴(kuò)散方式之一。形成多核巨細(xì)胞或合胞體。麻疹病毒形成的多核巨細(xì)胞病毒血清學(xué)試驗中和試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、紅細(xì)胞凝集及血凝抑制試驗，免疫熒光試驗、間接紅細(xì)胞凝集試驗及免疫酶測定法應(yīng)用抗原與抗體能特異性結(jié)合的原則?？捎靡阎《究乖瓉頊y定病人體內(nèi)未知抗體，也可用己知抗體來測定未知病毒抗原。將抗原-抗體反應(yīng)的特異性和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果，顏色深淺與待檢抗原、抗體水平相關(guān)。用酶標(biāo)儀測定光密度（OD)值以反映含量，靈敏度達(dá)ng-pg/ml水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）ELISA（雙抗夾心法）—檢測HBsAg以已知抗體(HBsAb)包被載體，洗滌

加含有待測抗原(HBsAg)

，抗原特異性結(jié)合抗體，洗滌再加酶標(biāo)記抗體，洗滌加底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)

ELISA－檢測HBsAg、HBeAg(操作）材料：HBsAg、HBeAg試劑盒1、包被抗-HBs反應(yīng)條4條，12孔/條2、酶結(jié)合物1瓶3、HBsAg陽性對照1瓶4、HBsAg陰性對照1瓶5、洗滌液:用前每瓶作1：20稀釋1瓶6、顯色劑（TMB）A1瓶7、顯色劑（H2O2）B1瓶8、終止液稀H2SO4

1瓶每孔加入待測標(biāo)本50μl，（設(shè)空白對照1孔，HBsAg陰性對照2孔，HBsAg陽性對照2孔，）酶結(jié)合物每孔1滴(50μl

、空白對照孔不加)充分混勻后，封板膜封板，置37℃孵育30分鐘

洗板五次后拍干

顯色劑A每孔1滴，顯色劑B每孔1滴混勻，37℃避光孵育1５分鐘每孔加終止液1滴(50μl)，混勻

比色法：波長450nm，空白孔校零，讀取各孔OD值編號加樣加酶封板洗滌顯色終止判斷結(jié)果目測法：蘭色-陽性無色-陰性

結(jié)果判定：臨界值=陰性對照均值×2.1（陰性對照值不足0.05，以0.05為準(zhǔn)）樣品OD值＞臨界值為陽性樣品OD值＜臨界值為陰性ThejudgmentoftheresultHBsAgHBeAgHBsAbHBeAbHBcAbinterpretation+----ActiveHBVinfectionorcarrier++---ActiveHBVinfection,eitheracuteorchronicorcarrier++--+ActiveHBVinfection,eitheracuteorchronic(veryinfectious)+--++Convalescenceofacuteinfection--+++Convalesce