2023學(xué)年完整公開課版抗體的制備

抗體的制備免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫—*—

抗體的制備抗體的類型及制備方法

1、多克隆抗體（PcAb）→免疫動(dòng)物AgAb—*—

抗體的制備抗體的類型及制備方法

2、單克隆抗體（McAb）→雜交瘤技術(shù)

3、基因工程抗體（GeAb）→基因工程技術(shù)AgAb免疫原的制備免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫—*—

免疫原的制備免疫原的制備類型1）人工抗原的制備2）顆粒性抗原的制備（綿羊紅細(xì)胞/細(xì)菌）3）可溶性抗原的制備（蛋白質(zhì)）—*—

設(shè)計(jì)情景提問免疫原的制備一位今天注射了青霉素的患者，抽血查血常規(guī)，血液靜置一段時(shí)間后，血細(xì)胞發(fā)生沉降，請(qǐng)問血液中的血細(xì)胞、血漿中的白蛋白、血漿中的青霉素小分子各自屬于哪一種抗原？A、顆粒性抗原；B、可溶性抗原；C、半抗原—*—

提問免疫原的制備上述三種抗原中：1）哪一種沒有免疫原性？要想具有免疫原性，怎么改造？2）最常用的載體是什么？一個(gè)載體上連接多少個(gè)半抗原才有好的啟動(dòng)能力？3）三種抗原中，哪一種的免疫原性最強(qiáng)？答案：1）半抗原，加載體可轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆乖?）牛血清白蛋白，20個(gè)以上；3）顆粒性抗原?！?—

提問免疫原的制備抽取綿羊血液時(shí)，下列四種盛血容器，哪一種用來盛裝血液最合適？—*—

免疫原的制備綿羊紅細(xì)胞制備采集新鮮綿羊紅細(xì)胞注入無菌并帶有玻璃珠的三角燒瓶內(nèi)，充分搖動(dòng)15分鐘后除去纖維蛋白，再以無菌生理鹽水洗滌3次，最后配成1×106/ml濃度的細(xì)胞懸液，即可應(yīng)用?！?—

免疫原的制備細(xì)菌抗原制備

細(xì)菌抗原有菌體抗原和鞭毛抗原等，多選用典型菌株的液體或固體培養(yǎng)物經(jīng)集菌后處理。鞭毛抗原需用有動(dòng)力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛處理，而菌體抗原則需要在100℃加溫2～2.5小時(shí)后應(yīng)用。（傷寒桿菌菌體抗原→“O”抗原；傷寒桿菌鞭毛抗原→“H”抗原。）

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情景設(shè)計(jì)免疫原的制備假設(shè)現(xiàn)在需要提取雞肝細(xì)胞里面的A蛋白（500KD），配成一定濃度作為抗原，從給定的三種動(dòng)物（鴨、兔、山羊）中選擇合適的動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室里免疫，一段時(shí)間后采血，分離血清，若得到抗體，從中提取出Ab1，并鑒定其效價(jià)和純度，最后選一個(gè)最好的方法保存起來。步驟：制備可溶性抗原（雞A蛋白）→免疫動(dòng)物→采血→提取、純化、鑒定Ab1→保存Ab1—*—

免疫原的制備可溶性抗原制備（1）組織勻漿的制備（高速搗碎法、研磨法）清洗雞肝臟、去除雜質(zhì)→粉碎肝組織成勻漿（糊狀）→離心，取上清液。（2）破碎細(xì)胞（方法：反復(fù)凍融法、超聲破碎法、溶菌酶處理法、自溶法、表面活性劑處理法）—*—

免疫原的制備可溶性抗原制備（3）提純A蛋白方法1：超速離心法（比重不同）方法2：選擇性沉淀法（如鹽析沉淀法溶解度不同）方法3：凝膠過濾（分子大小不同）方法4：離子交換層析（電荷不同）方法5：親和層析（抗原抗體結(jié)合具有特異性）方法6：電泳法（大小、形狀、帶電量不同）—*—

情景設(shè)計(jì)提問免疫原的制備假設(shè)杯子中有三種蛋白，A最?。ū戎兀?.001），C最大，B（比重：1.007）比A稍大，怎樣選擇超速離心法對(duì)此三種蛋白進(jìn)行初步分離？第一步：超速離心（分離大小相差大），上層A+B，下層為C；第二步：密度梯度離心（分離大小相差不大），需用分層液（如比重：1.005）—*—

提問免疫原的制備怎樣用鹽析沉淀法粗提血清中的IgG類抗體？將待提取的血清倒入50%飽和度的硫酸銨溶液中，血清中的白蛋白發(fā)生沉淀，吸出上清液，將上清液加入33%飽和度的硫酸銨溶液中，其中的IgG可發(fā)生沉淀。棄掉上清液，將沉淀復(fù)溶除鹽，即可獲得部分純化的IgG類抗體，完成粗提。動(dòng)畫：鹽析沉淀法粗提IgG類抗體—*—

情景設(shè)計(jì)提問免疫原的制備杯子里有待分離的兩種圓形抗原，分子量大的為Ag1，分子量小的為Ag2。此處有一個(gè)分離柱，里面填滿了圓形多孔凝膠小球，多孔凝膠上的小孔只能容納Ag2進(jìn)入，Ag1分子量大，不能進(jìn)入。在分離柱下方出樣口處準(zhǔn)備一個(gè)杯子，將含兩種不同抗原的液體從柱子進(jìn)樣口倒入柱內(nèi)，并用液體沖洗，Ag1和Ag2誰先出來呢？動(dòng)畫：凝膠過濾純化抗原—*—

情景設(shè)計(jì)提問免疫原的制備杯子里有待分離的兩種分子量相同的圓形抗原，分別是Ag1和Ag2，Ag1帶五個(gè)正電荷，Ag2帶一個(gè)正電荷。此處有一個(gè)分離柱，里面填滿了圓形凝膠小球，每個(gè)凝膠小球上都帶有負(fù)電。在分離柱下方出樣口處準(zhǔn)備一個(gè)杯子，將含兩種不同電荷的抗原液從柱子進(jìn)樣口倒入柱內(nèi)，并用液體沖洗，Ag1和Ag2誰先出來呢？動(dòng)畫：離子交換層析純化抗原—*—

情景設(shè)計(jì)提問免疫原的制備杯子里有待分離的兩種抗原，分別是Ag1和Ag2，Ag1為三角形，Ag2為圓形。此處有一個(gè)分離柱，里面填滿了圓形凝膠小球，每個(gè)凝膠小球上都包被有針對(duì)Ag1的相應(yīng)抗體。在分離柱下方出樣口處準(zhǔn)備一個(gè)杯子，將含有兩種不同抗原的液體從柱子進(jìn)樣口倒入柱內(nèi)，并用液體沖洗，Ag1和Ag2誰先出來呢？動(dòng)畫：親和層析純化抗原—*—

免疫原的制備可溶性抗原鑒定/保存（4）A蛋白鑒定

分子量、含量、純度和免疫活性。（5）A蛋白保存液態(tài)或干燥狀態(tài)低溫保存。—*—

免疫原的制備可溶性抗原+佐劑（6）準(zhǔn)備佐劑，與抗原乳化

佐劑（adjuvant）：是先于抗原或與抗原一起注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。免疫佐劑簡稱佐劑，為一類非特異性的免疫增強(qiáng)劑?！?—

免疫原的制備可溶性抗原+佐劑應(yīng)用：顆粒性抗原不用，可溶性抗原和人工抗原在初次免疫時(shí)用。最常用于免疫動(dòng)物的佐劑：弗氏佐劑（弗氏完全佐劑=弗氏不完全佐劑+卡介苗）—*—

免疫原的制備可溶性抗原+佐劑使用弗氏佐劑免疫動(dòng)物前，將佐劑與抗原體積比1:1混合，制成油包水狀態(tài)，檢測乳化是否成功的方法有：研磨法、注射器混合法。多克隆抗體的制備免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫—*—

多克隆抗體的制備抗血清/免疫血清/PcAb概念天然抗原常含有多種抗原決定簇，可刺激動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆針對(duì)該抗原的多種抗原決定簇產(chǎn)生不同的抗體，稱為多克隆抗體（PcAb）。將抗原以不同途徑免疫動(dòng)物，可從動(dòng)物血清中分離得到抗體，因而把這類含有抗體的血清稱為抗血清或免疫血清?！?—

情景設(shè)計(jì)多克隆抗體的制備假設(shè)現(xiàn)在需要提取雞肝細(xì)胞里面的A蛋白（500KD），配成一定濃度作為抗原，從給定的三種動(dòng)物（鴨、兔、山羊）中選擇合適的動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室里免疫，一段時(shí)間后采血，分離血清，若得到抗體，從中提取出Ab1，并鑒定其效價(jià)和純度，最后選一個(gè)最好的方法保存起來。步驟：制備可溶性抗原（雞A蛋白）→免疫動(dòng)物→采血→提取、純化、鑒定Ab1→保存Ab1—*—

提問多克隆抗體的制備現(xiàn)準(zhǔn)備了三種動(dòng)物，分別是鴨、兔和山羊，在4樓實(shí)驗(yàn)室里用于免疫從雞肝細(xì)胞內(nèi)提取的A蛋白，主要用于驗(yàn)證抗原刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生抗體的特性，選哪一種動(dòng)物好呢？—*—

提問多克隆抗體的制備1）如果這里分別有小兔子、大兔子、老兔子，選哪一種好呢？2）這里有活潑可愛、毛色發(fā)亮的健康大兔子，也有流鼻涕又拉稀的大兔子，選哪一種好呢？3）健康的雄兔子和健康的雌兔子，最好選哪一種？答案：大兔子；活潑可愛、毛色發(fā)亮；健康的雄兔子?！?—

多克隆抗體的制備免疫動(dòng)物選擇（1）種類：家兔、豚鼠、綿羊、馬、雞、山羊等；（2）Ag與免疫動(dòng)物種系差異越大，效果越好；（3）動(dòng)物個(gè)體適齡（體重符合要求）、健壯、無感染性疾?。ㄒ诵坌裕唬?）選用多只條件相同的動(dòng)物同時(shí)進(jìn)行免疫；—*—

多克隆抗體的制備免疫動(dòng)物選擇（5）抗原的性質(zhì)：適宜（蛋白質(zhì)→家兔、山羊/類固醇激素→家兔/酶類→豚鼠）；不適宜（IgE→綿羊/多種酶→山羊/胰島素→家兔）；（6）抗血清的要求：R型（兔型）→等價(jià)帶寬→診斷試劑/H型（馬型）→等價(jià)帶窄→治療試劑；抗體數(shù)量需求多→大動(dòng)物—*—

多克隆抗體的制備按設(shè)計(jì)的方案免疫（1）免疫量：在一定范圍內(nèi)，越大越好；（2）免疫途徑：皮內(nèi)（初次免疫）、皮下、肌肉、靜脈（加強(qiáng)免疫）、腹腔、淋巴結(jié)（抗原量少、珍貴）、腳掌等；（3）免疫時(shí)間間隔：第1次與第2次→10-20d；第2次之后→7-10d。—*—

多克隆抗體的制備動(dòng)物采血（1）時(shí)間：動(dòng)物免疫3～5次后，可取少量血清檢測抗體效價(jià)與特異性，測試合格后，應(yīng)在末次免疫后5～7d及時(shí)采血分離血清，采血前動(dòng)物禁食24h?！?—

多克隆抗體的制備動(dòng)物采血（2）方法：1）心臟采血法：小動(dòng)物；2）頸動(dòng)脈放血法：最常用的方法；3）靜脈采血法：可多次采；4）其他方法：摘除眼球、斷尾?！?—

多克隆抗體的制備抗血清分離/純化（1）抗血清分離：血液自然凝固，分離血清。（2）抗血清純化：1）IgG類抗體的純化：鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析。2）特異性抗體的純化：親和層析法、吸附劑方法?！?—

設(shè)計(jì)情景提問多克隆抗體的制備如免疫抗原有5種（4種雜質(zhì)Ag）：Ag1、Ag2、Ag3、Ag4和Ag5，免疫后產(chǎn)生5種抗體：Ab1、Ab2、Ab3、Ab4和Ab5，現(xiàn)需分離出Ab1，怎樣分離？方法1：親和層析法動(dòng)畫：親和層析法純化特異性抗體—*—

設(shè)計(jì)情景提問多克隆抗體的制備如免疫抗原有5種（4種雜質(zhì)Ag）：Ag1、Ag2、Ag3、Ag4和Ag5，免疫后產(chǎn)生5種抗體：Ab1、Ab2、Ab3、Ab4和Ab5，現(xiàn)需分離出Ab1，怎樣分離？方法2：吸附劑方法動(dòng)畫：吸附法純化特異性抗體—*—

多克隆抗體的制備抗血清鑒定（1）效價(jià)：放射免疫法/凝集反應(yīng)/雙擴(kuò)（舉例）等。（2）特異性：雙擴(kuò)等。（3）純度：電泳等。（4）親和力：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等?！?—

提問多克隆抗體的制備根據(jù)下圖回答：此抗原為顆粒性抗原還是可溶性抗原？抗體的效價(jià)是多少？答案：可溶性抗原；效價(jià)為1：8—*—

提問多克隆抗體的制備根據(jù)下面的雙擴(kuò)圖結(jié)果判斷：抗體是否純化成功？答案：純化不成功—*—

提問多克隆抗體的制備現(xiàn)得到PcAb100mL，需要將其保存起來，每次使用5mL，請(qǐng)問是100mL一起保存還是分裝為5mL小袋保存？為什么？保存方法有幾種？答案：小袋分裝；反復(fù)凍融影響抗體活性；3種—*—

多克隆抗體的制備抗血清保存（1）4℃保存，存3～6個(gè)月，加防腐劑。（2）低溫保存，－20℃～－40℃，在3～5年。（3）真空冰凍干燥，水分＜0.2％，5-10年單克隆抗體的制備免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫—*—

單克隆抗體的制備單克隆抗體概念/特性概念：是由單個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的僅針對(duì)一種抗原表位的高特異性抗體，可用雜交瘤技術(shù)制備。特性：理化性狀專一、生物活性專一、純度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化?！?—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的總體思路Ag致敏B細(xì)胞（產(chǎn)Ab）骨髓瘤細(xì)胞（無限繁殖）雜交瘤細(xì)胞（產(chǎn)Ab+無限繁殖）單克隆抗體（McAb）兩種細(xì)胞融合后產(chǎn)生的雜交細(xì)胞可同時(shí)保持雙方親代細(xì)胞的主要生物學(xué)特征—*—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本過程克隆選擇學(xué)說/細(xì)胞代謝缺陷補(bǔ)救的機(jī)制Ag（SRBC：多種表位）小鼠脾細(xì)胞（產(chǎn)Ab）小鼠骨髓瘤細(xì)胞（長期繁殖）+細(xì)胞融合PEGHAT培養(yǎng)篩選、檢測、克隆化B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株（目標(biāo)株）McAb—*—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法（1）細(xì)胞的選擇與制備1)免疫脾細(xì)胞動(dòng)物要求：與所用骨髓瘤細(xì)胞同源（小鼠），3-5只鼠齡8-12w的BALB/c健康小鼠?？乖螅侯w粒性抗原/可溶性抗原（+弗氏完全佐劑）。免疫途徑：腹腔或皮內(nèi)?！?—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法2)骨髓瘤細(xì)胞要求：來源與制備脾細(xì)胞動(dòng)物同一品系；自身不分泌Ig及CK，對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生Ab無抑制作用；可體外連續(xù)培養(yǎng)，生長快，倍增期短于24h；HGPRT缺陷株；處于對(duì)數(shù)生長期，形態(tài)良好。—*—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法3)飼養(yǎng)細(xì)胞常用：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備方法：冷凍果糖液注射腹腔，輕柔腹部幾次，吸出腹腔液，內(nèi)含巨噬細(xì)胞?！?—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法（2）細(xì)胞融合脾C（4份）+骨髓瘤C（1份）PEG，2min培養(yǎng)液稀釋混合物培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)—*—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法融合后的細(xì)胞混合物脾細(xì)胞瘤-瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞脾-脾細(xì)胞脾-瘤細(xì)胞—*—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法（3)雜交瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)1）DNA合成途徑主要合成途徑【原料：糖、AA、葉酸】替代途徑【原料：次黃嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）、HGPRT、TK】—*—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法2）HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（H）、甲氨蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）。其中A為葉酸拮抗劑。3）HAT培養(yǎng)混合細(xì)胞經(jīng)HAT培養(yǎng)后僅有脾-骨髓瘤C（混合物：針對(duì)Ag多種表位）?！?—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法（3)雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)從針對(duì)不同表位的雜交瘤細(xì)胞群體中篩選出針對(duì)目的抗原表位的特異性抗體分泌細(xì)胞。篩選的方法：多次進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，即克隆化。克隆化最常用的方法：有限稀釋法?！?—

單克隆抗體的制備有限稀釋法連續(xù)稀釋雜交瘤細(xì)胞懸液，使96孔板培養(yǎng)板每孔細(xì)胞數(shù)為一個(gè)，取每孔上清液，測抗體含量，抗體高分泌孔，多次克隆化（3～5次），獲雜交瘤細(xì)胞克隆。123456—*—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法（4)雜交瘤細(xì)胞凍存陽性克?。杭皶r(shí)凍存，液氮冷凍保存法（-196℃）—*—

單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的基本方法（5)McAb的大量制備1）體外培養(yǎng)法（單層細(xì)胞培養(yǎng)法、高密度培養(yǎng)法）2）動(dòng)物體內(nèi)誘生法（小鼠腹腔接