經(jīng)典液相色譜法

第十章液相色譜分析法學(xué)習(xí)目標(biāo)1.掌握色譜法的基本概念，吸附色譜法和分配色譜法的分離機(jī)制，薄層色譜法的基本原理及其應(yīng)用。2.熟悉色譜法的分類，離子交換色譜法和凝膠色譜法的分離機(jī)制，各種經(jīng)典的柱色譜法基本原理及其應(yīng)用。學(xué)會(huì)應(yīng)用薄層色譜法等對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定。3.了解色譜法的由來和發(fā)展。一、色譜法的由來1906年由俄國(guó)植物學(xué)家Tsweet分離植物色素時(shí)開始創(chuàng)立，現(xiàn)在已經(jīng)成為一種重要的分離、分析技術(shù)(分離混合物各組分并加以分析)。第一節(jié)概論Tsweet將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜法。茨維特(俄國(guó)植物生理學(xué)家和化學(xué)家)固定相——CaCO3顆粒流動(dòng)相——石油醚色譜柱——玻璃管色譜柱：裝有固定相的柱管（玻璃管或不銹鋼管）；

利用物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)（溶解性、極性、離子交換能力、分子大小等）的不同而進(jìn)行的分離、分析方法。固定相：裝填在柱管（玻璃管或不銹鋼管）內(nèi)靜止不動(dòng)的一相（固體或液體）；

流動(dòng)相：自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（進(jìn)行洗滌的氣體或液體）；流動(dòng)相固定相不同的顏色代表不同的組分色譜柱石油醚CaCO3二、色譜法定義色譜法構(gòu)成要素（“兩相一柱”）三、色譜法的發(fā)展柱色譜—20世紀(jì)初；發(fā)展趨勢(shì)：新型固定相和檢測(cè)器及各種檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)用。薄層、紙色譜—20世紀(jì)30～40年代；氣相色譜—20世紀(jì)50～60年代；高效液相色譜—20世紀(jì)70年代；超臨界流體色譜法毛細(xì)管電泳法……20世紀(jì)80年代初液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜流動(dòng)相固定相色譜類型四、色譜法的分類1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分：2．按固定相的固定方式分：3.按分離機(jī)制分：平面色譜紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜填充柱色譜毛細(xì)管柱色譜分配色譜：利用溶解性質(zhì)的差異進(jìn)行分離吸附色譜：利用吸附性能的差異進(jìn)行分離離子交換色譜：利用離子交換能力不同進(jìn)行分離空間排阻色譜：利用分子大小的不同進(jìn)行分離五、色譜法的特點(diǎn)色譜分析法具有“三高”、“一快”、“一廣”的特點(diǎn)：■高選擇性——可將性質(zhì)相似的組分分開；■高效能——利用組分性質(zhì)的差異，分離效果好；■高靈敏度——10-11～10-13g，適于痕量分析；■分析速度快——幾～幾十分鐘完成一個(gè)樣品分析；一次可以同時(shí)分析測(cè)定多種成分；■應(yīng)用范圍廣——?dú)怏w、液體、固體樣品或化學(xué)衍生化的樣品均可用色譜分離、分析一、色譜過程

色譜法是一種分離分析技術(shù)，是被分離物質(zhì)在兩相間（固相和液相）分配平衡的過程。以順式和反式偶氮苯的分離為例進(jìn)行說明：第二節(jié)色譜法的基本原理

開始，組分1、2都被吸附在柱上端的吸附劑上；洗脫時(shí)，組分1、2在兩相間進(jìn)行吸附、解吸附……作用；吸附劑對(duì)組分1、2的吸附力不同，差異變大，最終完成分離?！羯V分離是利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離?！粑侥芰Φ奈⑿〔町悺⑿〔町惙e累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出、吸附能力強(qiáng)的組分后流出。

結(jié)論：色譜法就是先將混合組分分離，然后進(jìn)行逐個(gè)分析的方法。１.分配系數(shù)（K）色譜分離過程是混合物中各組分在兩相間分配的過程，當(dāng)分配達(dá)到平衡時(shí)各組分被分離的程度可用“分配系數(shù)”來表示。二、色譜相關(guān)術(shù)語在一定的溫度和條件下，某組分在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，被分離組分在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比稱為分配系數(shù)，用“K”表示K在一定條件下是一常數(shù)，只與被分離組分本身的性質(zhì)有關(guān)?！癖Ａ魰r(shí)間：組分從洗脫開始到從柱中出來所需要的時(shí)間叫保留時(shí)間，用“tR”表示。2.保留值保留值包括：保留時(shí)間和保留體積?！癖Ａ趔w積：某組分從洗脫開始到從柱中出來所需要的流動(dòng)相體積叫保留體積，用“VR”表示。3.分配系數(shù)與保留值的關(guān)系

可見，色譜分離是利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力的微小差異而實(shí)現(xiàn)分離。分配系數(shù)的微小差異（吸附能力的微小差異）→微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出、吸附能力強(qiáng)的組分后流出。分配系數(shù)K值越大，則該組分在固定相中的濃度越大，表示被吸附劑吸附得越牢固，在柱中移動(dòng)的速度越慢，保留時(shí)間越長(zhǎng)，保留體積越大，流出越慢：反之則相反。分配系數(shù)不等是組分分離的前提。第三節(jié)柱色譜法

在柱中進(jìn)行色譜分離的方法稱為柱色譜法，根據(jù)分離原理的不同，柱色譜法分為:

是將固體吸附劑充填于色譜柱中作固定相，用流動(dòng)相進(jìn)行沖洗（洗脫）的色譜分離方法。吸附柱色譜法分配柱色譜法離子交換柱色譜法分子排阻柱色譜法柱色譜法一、吸附柱色譜法如果流動(dòng)相是液體則為液—固吸附柱色譜；如果流動(dòng)相是氣體則為氣—固吸附柱色譜。（以液—固吸附柱色譜為例進(jìn)行分析）固定相裝柱：如吸附劑Al2O3樣品混合組分（A+B）：從柱頂傾入流動(dòng)相：從頂部加入洗脫劑ABA、B兩組分隨流動(dòng)相的流動(dòng)而向下移動(dòng)，A、B組分在兩相不斷進(jìn)行著的溶解、吸附、再溶解、再吸附……過程，由于吸附劑對(duì)A、B存在吸附能力的差異，A、B移動(dòng)的速率有差異，從而使兩組分分離開來。A+B裝柱加樣洗脫1.吸附柱色譜法的分離原理

A、B組分有不同的吸附平衡常數(shù)K值。K值越大，平衡時(shí)該組分在固定相中的濃度越大，在柱中的移動(dòng)的速度越慢，則該組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)，保留體積越大，后流出色譜柱。組分在固定相與流動(dòng)相之間達(dá)到分配平衡時(shí)，分配系數(shù)稱為吸附平衡常數(shù)，用Ｋ來表示。2.固定相液—固吸附柱色譜的固定相常用固體吸附劑。（1）固體吸附劑的要求較大的表面積；較強(qiáng)的吸附力；顆粒均勻；顆粒細(xì)小。（2）常用的固定相吸附劑常用的固定相吸附劑有：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭、大孔吸附樹脂等。A.氧化鋁氧化鋁吸收一定的水分后活性會(huì)降低→脫活性（失活），氧化鋁的含水量越高，活性越低，吸附能力越差。堿性氧化鋁pH9～10分離堿性、中性物質(zhì)

中性氧化鋁

pH＞7.5分離酸性堿性和中性物質(zhì)

酸性氧化鋁pH4～5分離酸性、中性物質(zhì)硅膠表面有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心→適用于分離酸性或中性物質(zhì)B、硅膠1）硅醇基能與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵物質(zhì)極性↑，吸附能力↑。2）硅膠吸水→失活，加熱→活化

酰胺鍵結(jié)構(gòu)中存在的酚羥基可與酸類、酚類、硝基類以及醌類化合物形成氫鍵作用，因而用于這些化合物的分離分析，常用聚己內(nèi)酰胺。

特性：組分形成氫鍵能力↑強(qiáng)，組分越后出柱。C、聚酰胺非極性吸附劑，適用于水溶性物質(zhì)的分離。特點(diǎn)：在水中吸附力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱．因而水的洗脫能力最弱，有機(jī)溶劑較強(qiáng)。D、活性炭E、大孔吸附樹脂具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，利用吸附性和篩選性相結(jié)合的分離材料，適用于水溶性化合物的分離，如苷類化合物的分離?！窀鶕?jù)被分離組分的極性大小選擇被分離組分的極性越大，則被吸附劑吸附得越牢，因此需要極性較大的流動(dòng)相才能洗脫。流動(dòng)相的選擇應(yīng)考慮被測(cè)組分的極性、吸附劑能力的大小和流動(dòng)相的極性。3.流動(dòng)相及其選擇●根據(jù)吸附劑的活性大小選擇吸附劑的活性↑，對(duì)被測(cè)組分的吸附能力↑因此：強(qiáng)極性組分——選擇弱吸附劑弱極性組分——選擇強(qiáng)吸附劑分離極性大的物質(zhì)，選擇極性大的溶劑作流動(dòng)相；

分離極性小的物質(zhì)，選擇極性小的溶劑作流動(dòng)相?！跋嗨葡嗳堋痹瓌t：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑?！窀鶕?jù)被分離組分的溶解性選擇綜合以上三個(gè)方面的考慮，流動(dòng)相的選擇方法是：

被分離組分吸附劑流動(dòng)相強(qiáng)極性活性小強(qiáng)極性非(弱)極性活性大非極性或弱極性被測(cè)物質(zhì)的極性、吸附劑活性和流動(dòng)相極性之間的關(guān)系示意圖

■裝柱裝柱的方法有：干法裝柱和濕法裝柱。裝柱的要求是：均勻、平整■加樣■洗脫4.柱色譜的操作方法二、液---液分配柱色譜

固定相→機(jī)械吸附在惰性載體上的液體

流動(dòng)相→必須與固定相不為互溶的液體

惰性載體→僅起承載或支撐固定液的作用◆流動(dòng)相攜帶樣品流經(jīng)固定相時(shí)，各組分在兩相間不斷地進(jìn)行溶解、萃取，再溶解、再萃取的過程，分配系數(shù)大的組分移動(dòng)速度慢，分配系數(shù)小的組分移動(dòng)速度快。進(jìn)入固定相的組分分子進(jìn)入流動(dòng)相的組分分子固定相分離原理：利用混合物中不同組分在兩相溶劑中的溶解度不同（即分配系數(shù)不同）進(jìn)行分離。

固定相→離子交換樹脂

流動(dòng)相→水、酸或堿溶液適用范圍→只能分離離子型化合物三、離子交換柱色譜分離原理：利用各種被分離的離子與離子交換樹脂交換能力（親和力）的不同，因而在柱中移動(dòng)的速度不一樣而被分離。離子交換劑Θ固定離子組分離子⊕可交換陽離子陽離子交換色譜分離機(jī)制示意圖分離原理:

利用被測(cè)組分分子大小不同，小分子進(jìn)入凝膠內(nèi)部孔穴被滯留，大分子沿著凝膠顆粒之間的空隙隨流動(dòng)相下移，從而被分離。

固定相→有機(jī)物制成的分子篩（多孔性網(wǎng)狀物質(zhì)）

流動(dòng)相→溶解樣品用的溶劑四、分子排阻色譜（凝膠柱色譜）組分的分離取決于凝膠顆粒的孔徑大小和被分離物質(zhì)分子的大小。出柱順序：首先是大分子，其次是中等大小的分子，最后是小分子。。凝膠色譜分離機(jī)制示意圖O：凝膠顆粒o：大分子組分·：小分子組分

第四節(jié)薄層色譜法

將固定相（如吸附劑）均勻涂布在表面光滑的平板上形成薄層，在薄板上進(jìn)分離、分析的方法。鋪好固定相的板稱為薄板，樣品的分離就在薄板上進(jìn)行。與柱色譜不同，薄層色譜法是在平面上進(jìn)行分離，因此稱為平面色譜，紙色譜法也一樣，都是屬于平面色譜法。一、基本原理1.分類薄層色譜法按其分離原理可分為吸附、分配、離子交換和凝膠色譜法。其中，吸附薄層色譜法應(yīng)用最廣。固定相為吸附劑的薄層色譜法就是吸附薄層色譜法。其分離機(jī)制與吸附柱色譜的分離機(jī)制相似。固體吸附劑試樣溶液點(diǎn)在薄板的一端，當(dāng)展開劑（流動(dòng)相）攜帶樣品沿著薄板展開時(shí)，吸附劑對(duì)各組分的吸附能力有差別,展開劑對(duì)各組分的解吸附能力也不同，各組分移動(dòng)的速度不同而被逐漸拉開距離，從而實(shí)現(xiàn)分離。2.分離原理薄層色譜分離示意圖二、薄層色譜操作方法

將吸附劑涂鋪于光滑平整的玻璃板上使成厚度均勻一致的薄層叫做制板，制備好的板應(yīng)在105～110℃活化1小時(shí)，冷卻后備用。一般制成的薄板有兩種:1.制板、活化軟板：不加黏合劑硬板：加入黏合劑常用的硅膠薄板硅膠G——自含粘和劑硅膠H——不含粘和劑硅膠HF254——含熒光劑，254nm紫外光照發(fā)綠光硅膠HF365——含熒光劑，365nm紫外光照發(fā)光距板一端2cm處用鉛筆畫一細(xì)線作為起始線，畫“×”示點(diǎn)樣位置，用平頭毛細(xì)管或微量注射器點(diǎn)1～2滴試樣溶液于“×”處(點(diǎn)樣斑點(diǎn)稱為原點(diǎn))，斑點(diǎn)直徑不超過2～3mm，斑點(diǎn)間的距離為2cm點(diǎn)樣后用電吹干燥，點(diǎn)樣時(shí)間不超過10分鐘。2.點(diǎn)樣點(diǎn)樣3.展開點(diǎn)樣點(diǎn)不得浸入展開劑中，待展開劑展開到薄板的3/4高度時(shí)取出薄板，,標(biāo)記好前沿線。4.顯色取出薄板,檢查斑點(diǎn)有無顏色，若無色斑則用顯色劑顯色，然后標(biāo)出位置和斑點(diǎn)大小.5.定位找“兩點(diǎn)”、劃“兩線”、量“兩距離”兩點(diǎn)：原點(diǎn)和斑點(diǎn)兩線：起始線和溶劑前沿線兩距離：原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離6.計(jì)算比移值（1）比移值Rf原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離叫做比移值用“Rf”

表示。（2）相對(duì)比移值Rs試樣組分Rf,與對(duì)照品的Rf,值之比就稱為相對(duì)比移值Rs。

Rf(A)=a/cRf(B)=b/c

薄層色譜中一般要求各斑點(diǎn)的Rf值在0.2