生物化學(xué)檢驗(yàn)【課堂】核酸分離純化彭臻菲

職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)核酸分離純化技術(shù)BASICCLINICALLABORATORYMEDICINE2標(biāo)本：血液、尿液、唾液、分泌物、組織及培養(yǎng)細(xì)胞DNARNA核酸質(zhì)量要求結(jié)構(gòu)完整、純度、濃度核酸分離純化方法選擇原則：1、保證核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性;2、排除其他分子污染。根據(jù)不同標(biāo)本性質(zhì)、起始量以及待分離核酸性質(zhì)、用途采用不同的分離純化方案。2023/5/16核酸分離純化方法選擇（一）影響核酸一級結(jié)構(gòu)因素物理因素溫度0-４℃

避免反復(fù)凍融、高溫防止其他機(jī)械剪切力的作用例如基因組DNA分子細(xì)長，容易受到機(jī)械剪切力的作用而斷裂，所以機(jī)械剪切作用是分離大分子線性DNA的主要危險因素。

化學(xué)因素

pH４-1０，避免酸堿對核酸磷酸二酯鍵的破壞生物因素

避免核酸酶（DNA酶和RNA酶）破壞

采取措施：操作環(huán)境潔凈、操作者戴手套防止外來污染；所有器械及一些試劑應(yīng)進(jìn)行高溫滅菌處理；提取緩沖液加入核酸酶抑制劑。

DNA酶抑制劑

大多數(shù)DNA酶作用時需要二價金屬離子，如Ca2+,Mg2+等，因此加入EDTA（乙二胺四乙酸鈉），8-羥基喹啉等金屬離子螯合劑可抑制DNA酶活性；陰離子表面活性劑SDS，抑制DNA酶活性并沉淀蛋白。

RNA酶抑制劑（1）DEPC（焦炭酸二乙酯）

強(qiáng)烈的RNA酶抑制劑，可與RNA酶組氨酸殘基結(jié)合，抑制RNA酶活性。

劇毒易降解、需保存于低溫使用時，0.1%DEPC浸泡器械過夜或37

℃浸泡2h以上破壞單鏈核苷酸嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)，但有效濃度比蛋白變性濃度高100-1000倍

（2）其他RNA酶抑制劑肝素復(fù)合硅酸鹽RNase阻抑蛋白（RNasin）氧釩核糖核苷復(fù)合物

異硫氰酸胍

（二）影響核酸純度的因素

多糖、蛋白質(zhì)、脂類有機(jī)溶劑、金屬離子其他非目的核酸的核酸類物質(zhì)

核酸分離純化技術(shù)路線

細(xì)胞裂解核酸提取核酸純化步驟一：細(xì)胞裂解物理法：超聲波法、研磨法、勻漿法、凍融法

化學(xué)法：表面活性劑SDS、高鹽酶法：溶菌酶、蛋白酶K、裂解酶

破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，釋放胞內(nèi)核酸，同時可降解核酸結(jié)合蛋白，促進(jìn)核酸提取。

步驟二：核酸提取蛋白質(zhì)是核酸分離提取最大污染，將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分離且保證核酸結(jié)構(gòu)完整，是核酸分離提取的技術(shù)關(guān)鍵。常用核酸提取方法高鹽法（高濃度NaCl）NaCl加入，破壞核酸-蛋白靜電吸附力、氫鍵，使其解聚；RNA核蛋白與DNA核蛋白在NaCl溶液中溶解度不同，可以通過調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度分離RNA核蛋白與DNA核蛋白。

SDS法SDS可裂解細(xì)胞、抑制核酸酶活性，還是蛋白質(zhì)變性劑，使得核酸結(jié)合蛋白變性解離，促進(jìn)核酸提取。酚-氯仿抽提法

酚:氯仿：異戊醇=25:24:1酚：蛋白質(zhì)變性劑，DNA酶抑制劑氯仿：加速有機(jī)相與水相分層，去除酚異戊醇：降低表面張力，減少氣泡，使離心后水相、有機(jī)相、變性蛋白層相對穩(wěn)定

步驟三：核酸純化

通常采用沉淀法濃縮純化核酸

（1）易于改變核酸溶解緩沖液；

（2）易于調(diào)整核酸濃度；

（3）易于除去核酸中殘余鹽離子和雜質(zhì)。沉淀劑一：鹽NaA