生物化學檢驗【課堂】核酸分離純化彭臻菲

職業(yè)教育醫(yī)學檢驗技術專業(yè)教學資源庫生物化學檢驗技術核酸分離純化技術BASICCLINICALLABORATORYMEDICINE2標本：血液、尿液、唾液、分泌物、組織及培養(yǎng)細胞DNARNA核酸質量要求結構完整、純度、濃度核酸分離純化方法選擇原則：1、保證核酸分子一級結構的完整性;2、排除其他分子污染。根據不同標本性質、起始量以及待分離核酸性質、用途采用不同的分離純化方案。2023/5/16核酸分離純化方法選擇（一）影響核酸一級結構因素物理因素溫度0-４℃

避免反復凍融、高溫防止其他機械剪切力的作用例如基因組DNA分子細長，容易受到機械剪切力的作用而斷裂，所以機械剪切作用是分離大分子線性DNA的主要危險因素。

化學因素

pH４-1０，避免酸堿對核酸磷酸二酯鍵的破壞生物因素

避免核酸酶（DNA酶和RNA酶）破壞

采取措施：操作環(huán)境潔凈、操作者戴手套防止外來污染；所有器械及一些試劑應進行高溫滅菌處理；提取緩沖液加入核酸酶抑制劑。

DNA酶抑制劑

大多數(shù)DNA酶作用時需要二價金屬離子，如Ca2+,Mg2+等，因此加入EDTA（乙二胺四乙酸鈉），8-羥基喹啉等金屬離子螯合劑可抑制DNA酶活性；陰離子表面活性劑SDS，抑制DNA酶活性并沉淀蛋白。

RNA酶抑制劑（1）DEPC（焦炭酸二乙酯）

強烈的RNA酶抑制劑，可與RNA酶組氨酸殘基結合，抑制RNA酶活性。

劇毒易降解、需保存于低溫使用時，0.1%DEPC浸泡器械過夜或37

℃浸泡2h以上破壞單鏈核苷酸嘌呤環(huán)結構，但有效濃度比蛋白變性濃度高100-1000倍

（2）其他RNA酶抑制劑肝素復合硅酸鹽RNase阻抑蛋白（RNasin）氧釩核糖核苷復合物

異硫氰酸胍

（二）影響核酸純度的因素

多糖、蛋白質、脂類有機溶劑、金屬離子其他非目的核酸的核酸類物質

核酸分離純化技術路線

細胞裂解核酸提取核酸純化步驟一：細胞裂解物理法：超聲波法、研磨法、勻漿法、凍融法

化學法：表面活性劑SDS、高鹽酶法：溶菌酶、蛋白酶K、裂解酶

破壞細胞膜結構，釋放胞內核酸，同時可降解核酸結合蛋白，促進核酸提取。

步驟二：核酸提取蛋白質是核酸分離提取最大污染，將與核酸緊密結合的蛋白質分離且保證核酸結構完整，是核酸分離提取的技術關鍵。常用核酸提取方法高鹽法（高濃度NaCl）NaCl加入，破壞核酸-蛋白靜電吸附力、氫鍵，使其解聚；RNA核蛋白與DNA核蛋白在NaCl溶液中溶解度不同，可以通過調節(jié)NaCl溶液濃度分離RNA核蛋白與DNA核蛋白。

SDS法SDS可裂解細胞、抑制核酸酶活性，還是蛋白質變性劑，使得核酸結合蛋白變性解離，促進核酸提取。酚-氯仿抽提法

酚:氯仿：異戊醇=25:24:1酚：蛋白質變性劑，DNA酶抑制劑氯仿：加速有機相與水相分層，去除酚異戊醇：降低表面張力，減少氣泡，使離心后水相、有機相、變性蛋白層相對穩(wěn)定

步驟三：核酸純化

通常采用沉淀法濃縮純化核酸

（1）易于改變核酸溶解緩沖液；

（2）易于調整核酸濃度；

（3）易于除去核酸中殘余鹽離子和雜質。沉淀劑一：鹽NaA