臨床微生物檢驗(yàn)流程標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)班課件 6-呂火烊-腦脊液及無菌體液培養(yǎng)操作規(guī)范

腦脊液及無菌體液培養(yǎng)操作規(guī)范檢驗(yàn)中心呂火烊lab_lhx@126.com目錄?

腦脊液培養(yǎng)操作規(guī)范?

無菌體液培養(yǎng)操作規(guī)范（除外血液、腦脊液和尿菌）腦脊液培養(yǎng)操作規(guī)范?

腦脊液培養(yǎng)意義確定感染性腦膜炎中的病原體；提供抗菌藥物選擇的依據(jù)；評價抗感染治療的療效。?

提高腦脊液培養(yǎng)準(zhǔn)確性的難點(diǎn)臨床送檢樣本體積相對較少腦脊液中微生物含量較低（103cfu/ml

）操作不當(dāng)污染不可避免引起急性腦膜炎的普通細(xì)菌?

大腸埃希菌、無乳鏈球菌(B群新生兒鏈球菌)、單核細(xì)胞李斯特菌＜2個月

?

無乳鏈球菌、單核細(xì)胞李斯特菌、大腸埃希菌＜10歲

?

流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌引起急性腦膜炎的普通細(xì)菌?

腦膜炎奈瑟菌青少年?

肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌成人?

肺炎鏈球菌、革蘭陰性桿菌、單核細(xì)胞李斯特菌老年人?

CoNS、金黃色葡萄球菌、棒狀桿菌屬、痤瘡丙酸中樞神經(jīng)系統(tǒng)分流術(shù)后感染/腦室炎桿菌、需氧革蘭陰性桿菌、其它厭氧菌可引起中樞系統(tǒng)感染的其他病原體病毒：單純皰疹病毒、腸道病毒、西尼羅病毒等細(xì)菌：結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌屬、支原體、柔氏螺旋體、埃立克體屬等真菌：新型隱球菌、球霉菌屬和莢膜組織胞漿菌等原蟲：棘阿米巴原蟲腦脊液培養(yǎng)對樣本采集的要求?

腰椎穿刺或

Ommaya儲液囊液體或腦室引流液（醫(yī)生操作）?

至少采集3管，要求每管：≥3.0

ml第1管：生化常規(guī)（總蛋白、葡萄糖等）第2管：微生物學(xué)（培養(yǎng)、涂片、PCR）第3管：血液學(xué)（細(xì)胞計(jì)數(shù)等）腦脊液培養(yǎng)對樣本量的要求?

成人與兒童細(xì)菌培養(yǎng)+涂片革蘭染色：≥1.0

ml病毒培養(yǎng)：

≥0.5

ml隱球菌抗原+墨汁染色：

≥1.0ml真菌培養(yǎng)+熒光染色：

≥3.0

ml（疑似慢性腦膜炎的患者，為明確排除真菌感染，需要提供多達(dá)3管單獨(dú)的腦脊液樣本用于真菌培養(yǎng)。）AFB培養(yǎng)+抗酸染色：

≥3.0

ml（疑似慢性腦膜炎的患者，為明確排除AFB感染，需要提供多達(dá)3管單獨(dú)的腦脊液樣本用于AFB培養(yǎng)。）腦脊液培養(yǎng)對樣本量的要求?

成人與兒童（特殊病原體）亞急性海綿狀腦病(14-3-3蛋白)：≥3.0

ml病毒PCR：

≥1.0

ml西尼羅病毒：

≥1.0ml棘阿米巴原蟲：

≥10.0

ml厭氧培養(yǎng)+革蘭染色：

≥1.0ml腦脊液培養(yǎng)對樣本量的要求?

新生兒細(xì)菌培養(yǎng)+涂片革蘭染色：≥0.5

ml病毒培養(yǎng)：

≥0.2

ml培養(yǎng)樣本采樣后均應(yīng)即時送檢培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境要求1.常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)?

培養(yǎng)基：哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力平板；巰基乙酸肉湯（或兒童血培養(yǎng)瓶）?

培養(yǎng)環(huán)境：35-37℃，5-8%CO

氣體，培養(yǎng)48-96小時22.厭氧菌培養(yǎng)?

培養(yǎng)基：布氏血瓊脂平板、厭氧血培養(yǎng)基（瓶）?

培養(yǎng)環(huán)境：35-37℃，厭氧環(huán)境，培養(yǎng)至7天3.真菌培養(yǎng)?

培養(yǎng)基：沙保弱瓊脂平板、兒童血培養(yǎng)瓶?

培養(yǎng)環(huán)境：28-30℃，空氣、濕度不小于70%，培養(yǎng)至7天腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)的處理樣本量極少（﹤0.2

ml）與臨床溝通，優(yōu)先檢測最需要的項(xiàng)目其他部門可以獲取多余樣本其他部門無法獲取多余樣本獲取的樣本抗酸染色可培養(yǎng)的樣本用無菌移液槍頭取20l涂片（切勿涂開），于生物安全柜內(nèi)自然（干片機(jī)）干燥，甲醇固定后，行革蘭或抗酸染色在余下樣本管中加入0.5ml普通肉湯，混勻后，所有肉湯樣本分別肉湯涂片、接種血平板、巧克力平板、麥康凱平板，并35℃-37℃

CO

環(huán)境中培養(yǎng)，每天觀察墨汁染色2結(jié)果，至4天。腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)的處理樣本量少（0.2～1.0ml）與臨床溝通，優(yōu)先檢測最需要的項(xiàng)目其他部門可以獲取多余樣本其他部門無法獲取多余樣本獲取的樣本抗酸染色可培養(yǎng)的樣本用無菌移液槍頭取20l涂片（切勿鋪開），于生物安全柜內(nèi)自然（干片機(jī)）干燥，甲醇固定后，行革蘭或抗酸染色用無菌移液槍頭分別取20

接種血平板、巧克力l革蘭染色平板、麥康凱平板，35℃-37℃

CO2養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，至天。環(huán)境中培墨汁染色4革蘭染色與抗酸染色的處理方法如前所述余下樣本全部接種于增菌肉湯，有條件的單位可接種于兒童血培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)7天后報(bào)告結(jié)果腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)的處理樣本量1.0～3.0

ml用無菌移液槍頭分別取20

l接種血平板、巧克力平板、麥康凱平板，

35℃-37℃

CO

環(huán)境中培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，至4天。

不小于50

l接種沙保弱平板，

25℃-30℃

普通環(huán)境中培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，至7天。視樣本量，分別在細(xì)胞離心機(jī)二個加樣室中加不小于250

l樣本及1滴37%福爾馬林，按制造商的離心操作規(guī)程操作2所得涂片，甲醇固定后，用于革蘭染色與抗酸染色墨汁染色余下樣本全部接種于增菌肉湯，有條件的單位可接種于兒童血培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)5天后報(bào)告結(jié)果所有檢測均遵醫(yī)囑進(jìn)行腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)的處理樣本量足夠（≥3.0ml）用無菌移液槍頭分別取20

l接種血平板、巧克力平板、麥康凱平板，

35℃-37℃

CO

環(huán)境中培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，至4天。

不小于50

l接種沙保弱平板，

25℃-30℃

普通環(huán)境中培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，至7天。視樣本量，分別在細(xì)胞離心機(jī)二個加樣室中加不小于1.0ml樣本，按制造商的離心操作規(guī)程操作2所得涂片甲醇固定后，用于革蘭染色與抗酸染色墨汁染色余下樣本全部接種于增菌肉湯，有條件的單位可接種于兒童血培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)5天后報(bào)告結(jié)果所有檢測均遵醫(yī)囑進(jìn)行腦脊液厭氧菌培養(yǎng)的處理樣本量少（﹤2.0ml）用無菌移液槍頭分別取不小于100

l接種厭氧血平板于厭氧環(huán)境35℃-37℃

培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，至7天。示樣本量，在細(xì)胞離心機(jī)加樣室中加不小于250l樣本，按制造商的離心操作規(guī)程操作所得涂片甲醇固定后，用于革蘭染色剩余樣本接種厭菌肉湯培養(yǎng)，如有條件的單位可將剩余樣本接種于厭氧血培養(yǎng)瓶中，在血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)7天后報(bào)告結(jié)果所有檢測均遵醫(yī)囑進(jìn)行腦脊液厭氧菌培養(yǎng)的處理樣本量足夠（≥3.0ml）用無菌移液槍頭分別取不小于100

l接種厭視樣本量，在細(xì)胞離心機(jī)加樣室中加不小于1.0ml樣本，按制造商的離心操作規(guī)程操作氧血平板、和普通血平板，厭氧血平板于厭氧環(huán)境35℃-37℃

培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，至7天。

普通血平板，

35℃-37℃

普通環(huán)境中培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，至4天。所得涂片甲醇固定后，用于革蘭染色如有條件的單位可將不小于1.0ml樣本直接接種于厭氧血培養(yǎng)瓶中，在血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)7天后報(bào)告結(jié)果所有檢測均遵醫(yī)囑進(jìn)行腦脊液其他病原體的處理結(jié)核分枝桿菌的檢測推薦使用PCR法病毒檢測推薦使用PCR法隱球菌感染培養(yǎng)樣本量要足夠，沙保弱培養(yǎng)基25～30℃，普通環(huán)境培養(yǎng)至少5天二代測序在腦脊液病原學(xué)檢測中應(yīng)用腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)的鑒定與藥敏試驗(yàn)?

1.所有可見生長的微生物均需鑒定并及時報(bào)告臨床?

2.微生物的鑒定可依據(jù)各實(shí)驗(yàn)室使用的方法鑒定到種?

3.依據(jù)細(xì)菌在平板上生長的特性，通過革蘭染色、氧化酶、觸酶等可在2小時內(nèi)初步確定屬或種?

4.如果分離的菌株明顯是平板污染菌，或者僅在肉湯中分離到凝固酶陰性葡萄球菌

(CoNS)，則不需要完成全部鑒定或抗生素敏感性試驗(yàn)(AST)?

5.

如CoNS和棒狀桿菌屬分離株，來自分流術(shù)感染和頭部外傷患者中應(yīng)及時與臨床聯(lián)系確定是否需進(jìn)行一步鑒定與藥敏腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)的鑒定與藥敏試驗(yàn)?

6.對腸道和非發(fā)酵革蘭陰性桿菌、腸球菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、和其它有意義的葡萄球菌進(jìn)行AST檢測?

7.

流感嗜血桿菌：檢測β-內(nèi)酰胺酶。如果β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)陰性，AST試驗(yàn)檢測青霉素和氨芐青霉素，這兩種藥物均可用于治療?

8.

李斯特菌屬、無乳鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌，通常不進(jìn)行AST或β-內(nèi)酰胺酶檢測，否則可能導(dǎo)致錯誤結(jié)果。以上菌屬的青霉素耐藥株很少見；若檢測到非青霉素敏感菌株，需送至參考實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)?

9.對青霉素過敏的患者，與臨床醫(yī)生溝通后進(jìn)行AST檢測結(jié)果報(bào)告?

報(bào)告時限要求（分級報(bào)告）盡快報(bào)告革蘭染色結(jié)果，通常在接收標(biāo)本1小時之內(nèi)初步試驗(yàn)完成后，立即報(bào)告可能的屬和種對于陽性結(jié)果，書面通知臨床醫(yī)生?

報(bào)告方式：涂片結(jié)果：XX染色找到XX類型細(xì)菌；

XX染色未找到XX細(xì)菌說明：樣本的性狀、樣本量、涂片方式（直接還是離心）培養(yǎng)結(jié)果：培養(yǎng)XX天無細(xì)菌生長培養(yǎng)XX天，XX細(xì)菌，藥敏結(jié)果（如果需要）說明：是直接樣本接種還是肉湯增菌后接種結(jié)果解釋?

通常培養(yǎng)陽性表明有微生物感染。?

腦脊液中未觀察到WBCs不能排除感染，特別是李斯特菌感染所致疾病。?

最常見的社區(qū)獲得性細(xì)菌性腦膜炎的致病菌是肺炎鏈球菌。對于革蘭染色所見α-溶血鏈球菌，快速膽汁溶菌試驗(yàn)或莢膜膨脹實(shí)驗(yàn)是重要的快速診斷方法。?

腦脊液中若分離到腸球菌需引起注意。檢測到腸球菌提示可能為類圓線蟲病。?

假陽性結(jié)果可能來自標(biāo)本污染，或皮膚微生物群污染。?

假陰性結(jié)果可能由于微生物的數(shù)量太少，之前進(jìn)行抗生素治療，或感染的微生物難以培養(yǎng)。樣本保存?

檢測剩余的腦脊液在4度和/或在-20度保存一周，用于PCR和其它后續(xù)申請。?

對陽性培養(yǎng)平板至少保存7天，或冷凍菌株以便更長時間保存。腦脊液培養(yǎng)給臨床醫(yī)生的建議?

腦脊液的常規(guī)微生物學(xué)檢測（檢測細(xì)菌性腦膜炎），應(yīng)進(jìn)行以下項(xiàng)目申請：腦脊液總蛋白和葡萄糖；

細(xì)菌培養(yǎng)和染色?

腦脊液特殊微生物檢測，應(yīng)進(jìn)行以下項(xiàng)目申請：腦脊液總蛋白、葡萄糖、細(xì)胞計(jì)數(shù)、血葡萄糖；細(xì)菌、厭氧菌、真菌培養(yǎng)、革蘭染色、抗酸染色、墨汁染色；隱莢膜抗原檢測、病毒及結(jié)核分枝桿菌PCR檢測；棘阿米巴原蟲的檢測無菌體液培養(yǎng)操作規(guī)范（除外血液、腦脊液和尿菌）定義：這里的無菌體液是指來自于身體正常無菌部位的液體，包括：滑膜液（關(guān)節(jié)液）、胸腔積液（胸水）、腹膜液（腹水）、心包積液、盲管液（盤腔積液）和羊水特別說明：“盲管”是指盲袋直腸前壁與后壁的腔隙；積液經(jīng)陰道后穹窿穿刺采集常見病原體關(guān)節(jié)液胸腔積液腹膜液?

金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、厭氧菌?

淋病奈瑟菌、布氏菌屬、金氏金桿菌?

革蘭陰性桿菌、葡萄球菌屬、鏈球菌屬?

厭氧菌、分枝桿菌、諾卡菌屬、軍團(tuán)菌屬、真菌、阿米巴等?

葡萄球菌屬、-溶血鏈球菌、非發(fā)酵菌、革蘭陰性桿菌?

厭氧菌、念珠菌屬、其他真菌常見病原體心包液

?

金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌及其他-溶血鏈球菌、革蘭陰性桿菌、結(jié)核分枝桿菌、真菌等?

柯薩奇病毒、流感病毒、阿米巴等盲管液

?

厭氧菌、革蘭陰性桿菌、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、淋病奈瑟菌等?

衣原體、支原體、真菌、病毒等?

革蘭陰性桿菌、葡萄球菌屬、-溶血鏈球菌、淋病奈瑟菌等羊水?

厭氧菌、衣原體、支原體、真菌、病毒等樣本采集基本要求?

抗菌藥物使用前采集?

嚴(yán)格無菌操作?

建議使用穿刺法采集（細(xì)菌培養(yǎng)不建議使用引流的樣本）?

采集足夠的樣本量?

及時送檢培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境要求1.常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)?

培養(yǎng)基：哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力平板、MAC、EMB；需氧血培養(yǎng)瓶、厭氧血培養(yǎng)瓶?

培養(yǎng)環(huán)境：35-37℃，5-8%CO引流液培養(yǎng)2天2氣體培養(yǎng)，穿刺液培養(yǎng)4天，2.厭氧菌培養(yǎng)?

培養(yǎng)基：布氏血瓊脂平板、

哥倫比亞粘菌素奈啶酸瓊脂平板(CAN)、苯-酒精瓊脂平板、厭氧血培養(yǎng)基（瓶）?

培養(yǎng)環(huán)境：35-37℃，厭氧環(huán)境，培養(yǎng)至7天3.真菌培養(yǎng)?

培養(yǎng)基：沙保弱瓊脂平板、需氧血培養(yǎng)瓶?

培養(yǎng)環(huán)境：28-30℃，空氣、濕度不小于70%，培養(yǎng)至7天無菌體液細(xì)菌培養(yǎng)的處理用采樣針筒穿刺抽取足夠樣本量直接打入需氧血培養(yǎng)瓶、厭氧血培養(yǎng)瓶（打入針管中至少保留0.5ml，的樣本量視所用培養(yǎng)瓶的使用說明），一般不直接送到細(xì)菌室用于染色及直接平板接種，接種二塊血平板，二巧克力平板，一組在35℃-37℃

CO

環(huán)超過10ml，在血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)至7天2境中培養(yǎng)，一組在厭氧環(huán)境培養(yǎng)、每天觀察結(jié)果，至4天需氧瓶陽性厭氧瓶陽性抽取陽性瓶中樣本，涂片革蘭染色，接種二塊血平板，二巧克力平板，一組在35℃-37℃

CO

環(huán)境中培養(yǎng)，一組在厭氧環(huán)境培養(yǎng)、每天觀察結(jié)果，至4天抽取陽性瓶中樣本，涂片革蘭染色，接種一塊血平板，巧克力平板，

35℃-37℃樣本如果為腹膜液，其厭氧瓶陽性還應(yīng)接種MAC、EMB、CAN(哥倫比亞粘菌2CO

環(huán)境中培養(yǎng)，每天素奈啶酸瓊脂平板)、苯酒精瓊脂平板2觀察結(jié)果，至4天涂片方法:在酒精清洗過的玻璃片上加1-2滴樣本，不用涂開，自然干燥涂片結(jié)果及時告訴臨床，常規(guī)鑒定與藥敏無菌體液細(xì)菌培養(yǎng)的處理用采樣針筒穿刺抽取樣本量少記錄樣本量，外觀及凝固性樣本量只有1-2滴

樣本量大于（

<20l

）0.5ml只收到大于2ml樣本，

樣本量只有2-3滴，如果只收到血培養(yǎng)瓶樣本無血培養(yǎng)瓶無厭氧瓶抽取瓶中樣本（

≥0.5ml）接種巧克力平板以培養(yǎng)淋球菌只接種巧克力平板，

剩余樣本抽洗到肉湯培養(yǎng)基中，不用涂片，記錄樣本量于報(bào)告中取2-3滴（約20-30l）樣本接種血平板和巧克力平板取1ml樣本到10ml肉湯培養(yǎng)基中先進(jìn)行需氧培養(yǎng)，

樣本如果為腹涂片染色，如果樣本量足夠多接膜液或透析液，且送檢樣本在種厭氧血培養(yǎng)瓶，

厭氧環(huán)境中的，量不應(yīng)少于廠家推薦的體積將樣本接種厭氧培養(yǎng)基中涂片方法:在酒精清洗過的玻璃片上加1-2滴樣本，不用涂開，自然干燥平板上菌落涂片染色、所有涂片結(jié)果及時告訴臨床，常規(guī)鑒定與藥敏無菌體液細(xì)菌培養(yǎng)的處理?

關(guān)于引流管標(biāo)本的處理?

注意:不支持送檢引流管樣本,因?yàn)檫@容易被皮膚定值菌污染。最好直接吸取流出的液體標(biāo)本。?

消毒采集管：并無菌吸取引流管中液體。?

無菌密封杯運(yùn)送。?

不要將引流液接種血培養(yǎng)瓶，因?yàn)檫@種方式不太可能提高致病菌的檢出率。注意:不能用棉簽送檢，因?yàn)闃悠返臄?shù)量可能不足以確保培養(yǎng)出少量的生物。無菌體液細(xì)菌培養(yǎng)的處理結(jié)核分枝桿菌的檢測推薦使用PCR法衣原體、病毒檢測推薦使用PCR法其他特殊的病原體的檢測依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)使用合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境二代