熒光定量檢測(cè)技術(shù)

熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)目前一頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)所謂real-timeFQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。目前二頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)是一種完全閉管式的PCR和熒光探針雜交技術(shù)相結(jié)合的定量PCR方法。PCR的高效擴(kuò)增特性核酸探針的高特異性光譜技術(shù)的高靈敏性和可計(jì)量性目前三頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義

利用熒光信號(hào)對(duì)PCR反應(yīng)的過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控目的

對(duì)起始模板進(jìn)行定量?jī)?yōu)點(diǎn)

靈敏，重復(fù)性，動(dòng)態(tài)范圍寬，高通量原理

Ct值與起始模板濃度的對(duì)數(shù)成比例目前四頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺(tái)期。在傳統(tǒng)的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來(lái)檢測(cè)PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對(duì)PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。

目前五頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)利用電泳定量11,500counts/5200counts=2.2folddifference目前六頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理在real-timeQ-PCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。目前七頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來(lái)推斷模板最初的含量。目前八頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在real-timeQ-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值（threshold）。以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。threshold=10´SDcycle6-15

目前九頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是真正的信號(hào)，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。目前十頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)什么是C(t)值C(t)Threshold（域值）目前十一頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)為什么要引入C(t)值CtEndpoints96replicatesofB7genemolecularbeacon目前十二頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。目前十三頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量Ct18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifference目前十四頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。目前十五頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)如何定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

未知樣品的C(t)值

定量目前十六頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)熒光化學(xué)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。熒光探針：TaqMan熒光探針

熒光染料：SYBR熒光染料

目前十七頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)一、TaqMan檢測(cè)技術(shù)原理PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，與擴(kuò)增片斷內(nèi)部某一段系列相同或互補(bǔ)，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。目前十八頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

目前十九頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)TaqMan檢測(cè)技術(shù)

原理示意圖PCR擴(kuò)增前PCR擴(kuò)增時(shí)上游引物完好探針DNA合成熒光物質(zhì)熒光淬滅物質(zhì)探針?biāo)猓尫艧晒饽０遑?fù)鏈目前二十頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)TaqMan?探針未結(jié)合的探針探針、引物與目的片段結(jié)合，F(xiàn)RET光發(fā)射或者以熱量形式散失Donordye(Reporter)Acceptordye(Quencher)LightEnergytransferTaqTaq水解探針，報(bào)告熒光素與淬滅熒光素分離TaqLightEmissionLight目前二十一頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)TaqMan檢測(cè)技術(shù)的設(shè)計(jì)與普通PCR的設(shè)計(jì)基本相同，區(qū)別在于引物與探針的設(shè)計(jì)一般需要特定的軟件，如美國(guó)ABI公司開(kāi)發(fā)的PrimerExpress軟件。目前二十二頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)（一）選擇靶基因TaqMan技術(shù)主要用于檢測(cè)，所以其擴(kuò)增的基因必須是特異的，如：某種病原微生物所共有的保守基因（檢測(cè)某種病原微生物）；某個(gè)血清型所特有的基因序列（區(qū)分檢測(cè)某個(gè)血清型）；選擇決定毒力強(qiáng)弱的基因（區(qū)分強(qiáng)毒和弱毒）等。目前二十三頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)（二）選擇探針選擇探針需要同時(shí)滿足以下條件：1、在靶基因的保守區(qū)域2、G+C含量在40%以上；3、相同堿基連續(xù)不超過(guò)4個(gè)；4、Tm值在71±2℃;目前二十四頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)（二）選擇探針5、內(nèi)部自身配對(duì)較少；6、5’端不為G；7、G數(shù)目比C數(shù)目少；如果6和7難以滿足的時(shí)候，就要考慮用互補(bǔ)序列作探針。目前二十五頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)（三）選擇引物探針選好之后，在探針的上下游分別選擇合適的引物序列，引物應(yīng)滿足如下的條件:1、在靶基因保守和無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域；2、與探針?biāo)趨^(qū)域不重疊；目前二十六頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)（三）選擇引物3、與靶基因其他區(qū)域配對(duì)較少；4、G+C含量在40%以上；5、相同堿基連續(xù)不超過(guò)4個(gè)；6、Tm值比探針Tm值低10±1℃;目前二十七頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)（三）選擇引物7、探針與兩條引物之間的各種組合形成的二聚體都較少，特別是引物3’端與探針配對(duì)很少；8、PCR擴(kuò)增片斷在70—250個(gè)堿基之間。如果找不到合適的引物，可調(diào)整探針（向前或向后）的序列，或重新選擇一個(gè)探針，再尋找合適的引物。目前二十八頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)普通PCR臨床檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)普通PCR臨床檢測(cè)技術(shù)雖然解決了檢出率低、周期長(zhǎng)的問(wèn)題，但由于假陽(yáng)性率高，不能正確指導(dǎo)臨床實(shí)踐。因此國(guó)家衛(wèi)生部曾在1997年行文禁止將普通PCR技術(shù)用于臨床診斷。

目前二十九頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)1、采用閉管檢測(cè)，不需PCR后處理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系統(tǒng)，擴(kuò)增和檢測(cè)一次同時(shí)完成。不需開(kāi)蓋，不產(chǎn)生污染，避免了假陽(yáng)性。FQ-PCR與普通PCR的區(qū)別目前三十頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)2、探針與被檢DNA序列特異雜交，增強(qiáng)了特異性。A、上下游引物和探針三道關(guān)卡控制其特異性；B、引物和探針都比較長(zhǎng)，退火溫度較高，非特異性擴(kuò)增幾率減少。FQ-PCR與普通PCR的區(qū)別目前三十一頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)3、可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治療恢復(fù)情況。FQ-PCR與普通PCR的區(qū)別目前三十二頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)FQ-PCR與普通PCR的區(qū)別4、光譜分析儀直讀結(jié)果，自動(dòng)分析，增強(qiáng)了靈敏性和客觀性。能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)，即一邊PCR，一邊檢測(cè)PCR的結(jié)果，而不需要在PCR結(jié)束之后進(jìn)行核酸電泳來(lái)顯示PCR反應(yīng)的結(jié)果，（因此實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)操作更簡(jiǎn)單；也避免了核酸電泳非常難以回避的化學(xué)污染和核酸污染等嚴(yán)重問(wèn)題）；目前三十三頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)FQ-PCR與普通PCR的區(qū)別5、可以多重檢測(cè)。如果檢測(cè)兩種以上的基因片斷，可以對(duì)各個(gè)基因分別設(shè)計(jì)探針和引物，在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行TaqMan檢測(cè)，或者將各自的探針?lè)謩e標(biāo)記不同的熒光信號(hào)，在同一個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)多個(gè)基因片斷。目前三十四頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)二、SYBR熒光染料原理在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。目前三十五頁(yè)\總數(shù)三十七頁(yè)\編于十九點(diǎn)ssDNA=freedye(weakfluorophore)dsDNA=Bindsminorgroove(intensefluorophore)SYBRGreenI

(雙鏈DNA結(jié)合染料)目前三十六頁(yè)\總數(shù)三十七