第六章克隆基因的表達(dá)

優(yōu)選第六章克隆基因的表達(dá)目前一頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)一.原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)①原核生物只有一種RNA聚合酶識別原核細(xì)胞的啟動子，催化所有RNA的合成。②原核生物的表達(dá)是以操縱子為單位的。操縱子是數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)的結(jié)合，是一個基因表達(dá)的協(xié)同單位。調(diào)控區(qū)主要分為三個部分：操縱子(operator)、啟動子(promotor)及其他有調(diào)控功能的部位。目前二頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)

③由于原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的。原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，轉(zhuǎn)錄成mRNA后，可直接在胞漿中與核糖體結(jié)合翻譯形成蛋白質(zhì)。在翻譯過程中，mRNA可與一定數(shù)目的核糖體結(jié)合形成多核糖體。兩個核糖體之間有一定長度的間隔，為裸露的mRNA。每個核糖體可獨(dú)立完成一條肽鏈的合成，即這種多核糖體可以同時在一條mRNA鏈上合成多條肽鏈，大大提高了翻譯效率。目前三頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)

④原核基因一般不含有內(nèi)含子(intron)，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。因此當(dāng)克隆的含有內(nèi)含子的真核基因在原核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成mRNA前體后，其中內(nèi)含子部分不能被切除。

⑤原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物的直接控制要慢。對RNA合成的控制有兩種方式，一是起始控制(啟動子控制)，二是終止控制(衰減子控制)。

目前四頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)

⑥在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有一個翻譯起始密碼子及同16S核糖體RNA3’末端堿基互補(bǔ)的序列，即SD序列，而真核基因則缺乏此序列。1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3～10bp處的由3~9bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16SrRNA3’末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點(diǎn)。

目前五頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)因此，欲將外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，必須滿足以下條件：①通過表達(dá)載體將外源基因?qū)怂拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；②外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA；目前六頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)③必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動子和S-D序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)；④外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(openreadingframe，ORF)；⑤利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主菌的毒害。目前七頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)二.基因表達(dá)的調(diào)控序列

如上所述，由于原核和真核細(xì)胞中基因表達(dá)的機(jī)制是不同的，因此必須詳細(xì)了解基因表達(dá)過程中的各種調(diào)控因子，構(gòu)建高效的表達(dá)載體，才能達(dá)到高效率、高水平表達(dá)外源基因的目的。對原核生物來講，基因表達(dá)的調(diào)控序列主要涉及啟動子、S-D序列、終止子、衰減子等序列。

目前八頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)

1．啟動子(promotor)啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列，沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。啟動子有兩個保守區(qū)：（1）Pribnow盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5—10bp，一般由6～8個堿基組成，富含A和T，故又稱為TATA盒或—10區(qū)。啟動子來源不同，Pribnow盒的堿基順序稍有變化。（2）—35區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35bp處，故稱—35區(qū)，一般由10個堿基組成。目前九頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)啟動子有強(qiáng)弱之分，雖然原核細(xì)胞僅靠一種RNA聚合酶就能負(fù)責(zé)所有RNA的合成，但它卻不能識別真核基因的啟動子。為了表達(dá)真核基因，必須將其克隆在原核啟動子的下游，才在原核表達(dá)系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)錄。在原核生物表達(dá)系統(tǒng)中，通常使用的可調(diào)控的強(qiáng)啟動子有l(wèi)ac(乳糖啟動子)、trp(色氨酸啟動子)、PL和PR(λ噬菌體的左向和右向啟動子)以及tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子)等。目前十頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)2．S-D序列

mRNA在細(xì)菌中的轉(zhuǎn)譯效率依賴于是否有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的存在，即S-D序列以及S-D序列與起始密碼子AUG之間的距離。在原核細(xì)胞中，當(dāng)mRNA結(jié)合到核糖體上后，翻譯或多或少會自動發(fā)生。細(xì)菌在翻譯水平上的調(diào)控是不嚴(yán)格的，只有RNA和核糖體的結(jié)合才是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵。

目前十一頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)S-D序列與起始密碼子之間的距離，是影響mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)的主要因素之一。Marqiusv等發(fā)現(xiàn)當(dāng)lac啟動子的S-D序列距AUG為7個核苷酸時，表達(dá)最高，為2581單位；而間隔8個核苷酸時，表達(dá)水平降到不足5單位，這說明S-D序列與AUG的距離將顯著地影響基因的表達(dá)水平。

目前十二頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)3．終止子在一個基因的3’端或是一個操縱子的3’端往往還有一特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一DNA序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子(terminator)。共同的特點(diǎn)，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)，這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。目前十三頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)在構(gòu)建表達(dá)載體時，為防止由于外源基因的表達(dá)干擾了載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點(diǎn)的下游插入一段很強(qiáng)的核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。目前十四頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)4．衰減子

衰減子(attenuator)是指在某些前導(dǎo)序列中帶有控制蛋白質(zhì)合成速率的調(diào)節(jié)區(qū)。在原核生物中，一條mRNA分子常常編碼數(shù)種不同的多肽鏈。這種多順反子mRNA的頭一條多肽鏈合成的起始點(diǎn)，同RNA分子的5，—P末端間的距離可達(dá)數(shù)百個核苷酸。這段位于編碼區(qū)之前的不轉(zhuǎn)譯的mRNA區(qū)段，叫做前導(dǎo)序列。目前十五頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)三、幾種類型的原核表達(dá)載體在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因時，總的來說可產(chǎn)生融合型和非融合型表達(dá)蛋白。不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達(dá)蛋白稱為非融合蛋白。非融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于它具有非常接近于真核細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。非融合蛋白的最大缺點(diǎn)是容易被細(xì)菌蛋白酶所破壞。

目前十六頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)融合蛋白是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的蛋白質(zhì)由一條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。含原核細(xì)胞多肽的融合蛋白是避免細(xì)菌蛋白酶破壞的最好措施。另外為表達(dá)產(chǎn)物的分離純化等提供了極大的方便。

目前十七頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)基因工程的載體有克隆載體和表達(dá)載體之分?？寺≥d體中都有一個松弛型復(fù)制子，能帶動外源基因在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增，這類載體已經(jīng)作過介紹。表達(dá)載體是適合在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。組建這類載體比較困難，下面簡要介紹幾種常用的原核表達(dá)載體。目前十八頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)1.非融合型表達(dá)蛋白載體pKK223-3目前十九頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)2．分泌型克隆表達(dá)載體pinⅢ系統(tǒng)

作為分泌克隆表達(dá)載體中關(guān)鍵的編碼信號肽的序列，是取自于大腸桿菌中分泌蛋白的基因ompa(外膜蛋白基因)。

目前二十頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)目前二十一頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)3．融合型蛋白表達(dá)載體pGEX系統(tǒng)

pGEX系統(tǒng)由Pharmacia公司構(gòu)建，載體的組成成分基本上與其他表達(dá)載體相似，含有啟動子tac及l(fā)ac操縱基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。這類載體與其他表達(dá)載體不同之處在于S-D序列下游是谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶基因，而克隆的外源基因則與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶基因相連。當(dāng)進(jìn)行基因表達(dá)時，表達(dá)產(chǎn)物為谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和目的基因產(chǎn)物的融合體。

目前二十二頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)目前二十三頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)四、提高克隆基因表達(dá)效率的途徑

必須設(shè)法提高克隆基因的表達(dá)效率。就目前所知，有許多因素，諸如啟動子的強(qiáng)度、DNA轉(zhuǎn)錄起始序列、密碼子的選擇、mRNA分子的二級結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性和寄主細(xì)胞的生理特征等，都會不同程度地影響到克隆基因的表達(dá)效率，而且大多數(shù)都是在翻譯水平上發(fā)生影響作用的，因而必須從分析這些因素入手，尋找提高克隆基因表達(dá)效率的有效途徑。目前二十四頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)1．啟動子結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響為了鑒定出最強(qiáng)的啟動子，必須創(chuàng)建出衡量不同啟動子轉(zhuǎn)錄效率的研究系統(tǒng)。這一系統(tǒng)已由Russell等(1982)創(chuàng)建，他們將任何待測的啟動子置于無啟動子但處于載體上的半乳糖激酶結(jié)構(gòu)基因(GalK)的前方，根據(jù)在GalK寄主中所合成的半乳糖激酶的水平，衡量啟動子的強(qiáng)弱。結(jié)果表明，受檢啟動子的強(qiáng)弱與它們的一致序列（即與-10和-35區(qū)序列）相似的程度成正比。進(jìn)一步的研究表明，—35和—10區(qū)之間的距離也是一個重要因素。如果間隔為17個堿基對，啟動子表現(xiàn)很強(qiáng)，如果大于17個堿基對，啟動子表現(xiàn)較弱。目前二十五頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)2．轉(zhuǎn)譯起始序列對表達(dá)效率的影響實(shí)驗(yàn)證明，連接在S—D序列后面的4個堿基成分的改變會對轉(zhuǎn)譯效率發(fā)生很大的影響。如果這個區(qū)域是由4個A(T)堿基組成，其轉(zhuǎn)譯作用最為有效；而當(dāng)這個區(qū)域是由4個C堿基或4個G堿基組成，其轉(zhuǎn)譯效率只及最高轉(zhuǎn)譯效率的50％或25％。目前二十六頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)3．啟動子同克隆基因間距離對表達(dá)效率的影響啟動子與結(jié)構(gòu)基因間的距離在蛋白質(zhì)翻譯上有巨大作用。進(jìn)一步的研究還表明：①翻譯的起始點(diǎn)和S—D序列必須接近到一定程度；

②翻譯的起始包括活化的30S核糖體亞基和mRNA5’末端區(qū)域間的互作，這時mRNA的5’末端已折疊成特殊的二級結(jié)構(gòu)。基因表達(dá)水平的改變是mRNA二級結(jié)構(gòu)的反映。目前二十七頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)4．轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對克隆基因表達(dá)效率的影響

在克隆基因的末端，存在一個轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是十分重要的，其原因有如下幾個方面：若干非必須的轉(zhuǎn)錄本的合成，會使細(xì)胞消耗巨大的能量用于制造大量非必須的蛋白質(zhì)；(2)在轉(zhuǎn)錄本上有可能形成一些不期望其出現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu)，從而降低了轉(zhuǎn)譯的效率；(3)偶然會出現(xiàn)啟動子阻塞現(xiàn)象，也就是說，克隆基因啟動子所開始的轉(zhuǎn)錄，會干擾另一個必要的基因或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)譯。

目前二十八頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)5．質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響提高克隆基因表達(dá)效率的途徑之一是增加相應(yīng)的mRNA分子的數(shù)量。第一種是啟動子的強(qiáng)度，這在前面已經(jīng)作了討論；第二種是基因的拷貝數(shù)。提高基因的拷貝數(shù)(即基因的劑量)最簡單的辦法是，將基因克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上。根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，隨著重組體克隆基因表達(dá)水平的上升，寄主細(xì)胞的生長速率便會相應(yīng)地下降，同時形態(tài)上也會出現(xiàn)一些明顯的變化，例如細(xì)胞纖維化和脆弱性增加等。

目前二十九頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)6．提高翻譯水平常用的途徑(1)調(diào)整S-D序列與AUG間的距離提高外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)水平的關(guān)鍵因素之一是調(diào)整S-D序列和起始密碼子ATG之間的距離，此距離過長、過短都影響真核基因的表達(dá)。S-D序列距AUG為7個核苷酸時最合適。目前三十頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)(2)用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基

翻譯的起始是決定翻譯水平高低的一個重要因素。有資料表明，由于緊隨起始密碼下游的幾組密碼子不同，可使基因的表達(dá)效率相差15～20倍。這主要是改善了翻譯的起始和mRNA的二級結(jié)構(gòu)。

目前三十一頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)(3)增加mRNA的穩(wěn)定性

多數(shù)情況下，細(xì)菌的mRNA的半衰期很短，一般僅為1-2min，而外源基因mRNA的半衰期可能更短。若能增加mRNA的穩(wěn)定性，則有可能提高外源基因的表達(dá)水平。研究表明，大腸桿菌的“重復(fù)性基因回文序列”具有穩(wěn)定mRNA的作用，能防止外切酶的攻擊。因此，在外源基因下游插入此序列或其他具有反轉(zhuǎn)重復(fù)順序的DNA片段可起到穩(wěn)定mRNA、提高表達(dá)水平的作用。

目前三十二頁\總數(shù)三十五頁\編于十八點(diǎn)7．減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷外源基因在細(xì)菌中高效表達(dá)，必然影響宿主的生長和代謝；而細(xì)胞代謝的損傷，又必然影響外源基因的表達(dá)。合理地調(diào)節(jié)好宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系，是提高外源基因表達(dá)水平不可缺少的一個環(huán)節(jié)。目前三十三頁\總數(shù)三十五頁\編于十八