熒光原理及應(yīng)用詳解演示文稿

熒光原理及應(yīng)用詳解演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部?jī)?yōu)選熒光原理及應(yīng)用目前二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部產(chǎn)品概述目前三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部乙肝病毒(HBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒丙肝病毒(HCV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒結(jié)核桿菌(TB)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒沙眼衣原體和淋球菌(CT&NG)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光雙檢試劑盒已獲得新藥證書(shū)的產(chǎn)品目前四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部TORCH計(jì)劃中的產(chǎn)品人巨細(xì)胞病毒(HCMV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒人乳頭瘤病毒(HPV6/11;16/18)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒人單純皰疹病毒(HSV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢試劑盒弓形蟲(chóng)(TOX.)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢試劑盒風(fēng)疹(RUB.)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒其他產(chǎn)品解脲支原體(UU)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒乙肝病毒(HBV)YMDD突變核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒待申報(bào)產(chǎn)品目前五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部幽門(mén)螺旋桿菌(HP)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒肺炎支原體(MP)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒EB病毒(EBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒梅毒(TP)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢試劑盒-地中海貧血(MA)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒苯丙酮尿癥(PKU)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢試劑盒開(kāi)發(fā)研制中的新產(chǎn)品目前六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部新藥試生產(chǎn)轉(zhuǎn)

正式生產(chǎn)

批件

乙型肝炎病毒（HBV）核酸擴(kuò)增（PCR）熒光定量檢測(cè)試劑盒

國(guó)藥準(zhǔn)字S20020033目前七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR基礎(chǔ)目前八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR---DNA體外復(fù)制目前九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR——信號(hào)放大目前十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR的特點(diǎn)高靈敏度高特異性簡(jiǎn)便快捷目前十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光PCR檢測(cè)原理目前十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光PCR？

熒光標(biāo)記引物、探針或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化目前十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光染料光能熱能轉(zhuǎn)移給臨近的分子目前十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光信號(hào)熒光染料直接結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物SYBRgreenI——特異性結(jié)合雙鏈，釋放熒光信號(hào)熒光標(biāo)記引物特異性熒光探針Taqman雙熒光標(biāo)記探針molecularBeacon熒光標(biāo)記探針熒光標(biāo)記雜交雙探針目前十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部FRET？

當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長(zhǎng)（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）的熒光基團(tuán)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),實(shí)際相當(dāng)于將短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽。目前十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部Taqman？特異性熒光雙標(biāo)記探針Taq酶5’→3’外切酶活性目前十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部Molecularbeacon？目前十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光標(biāo)記雜交雙探針變性退火延伸目前十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部CT值—樣本擴(kuò)增曲線(xiàn)與閾值線(xiàn)交叉點(diǎn)的循環(huán)數(shù)目前二十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR熒光試劑標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(xiàn)（儀器：Bio-radiCycler）1x108拷貝/ml1x107拷貝/ml1x106拷貝/ml1x105拷貝/ml1x104拷貝/ml目前二十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部定量原理和方法原理：每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。外標(biāo)法：將幾個(gè)已知拷貝數(shù)的純化的目的基因標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增，繪制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。內(nèi)標(biāo)法：將已知濃度的內(nèi)標(biāo)基因加到各標(biāo)本中，與標(biāo)本一起經(jīng)歷核酸提取、加樣、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增及信號(hào)檢測(cè)的全過(guò)程，比較內(nèi)標(biāo)最后的實(shí)測(cè)值與已知值，以檢驗(yàn)標(biāo)本中是否存在抑制PCR的因素，也可對(duì)樣品的拷貝數(shù)加以校正。

目前二十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光PCR定量的原理-外標(biāo)法目前二十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)→定量目前二十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部對(duì)數(shù)期分析與終點(diǎn)分析的比較目前二十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光PCR重現(xiàn)性目前二十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光PCR特點(diǎn)靈敏度高特異性強(qiáng)全封閉PCR過(guò)程，無(wú)需后處理采用dUTP—UNG酶的防污染系統(tǒng)，有效降低污染機(jī)會(huì)即時(shí)反映擴(kuò)增過(guò)程，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，更適用于定量定量范圍寬，可達(dá)到10個(gè)數(shù)量級(jí)，無(wú)須稀釋樣品可實(shí)現(xiàn)一管多檢儀器自動(dòng)分析，更快獲得結(jié)果目前二十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部競(jìng)爭(zhēng)性熒光內(nèi)標(biāo)(IC)定量PCR技術(shù)目前二十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部競(jìng)爭(zhēng)性熒光內(nèi)標(biāo)(IC)什么是IC?

Internalcontrol簡(jiǎn)稱(chēng)IC，通常是指與靶序列十分相似的一段DNA序列，兩者在相同的條件下可被同一對(duì)引物擴(kuò)增，具有相同的擴(kuò)增效率；區(qū)別在于兩者的探針結(jié)合區(qū)，可分別被不同序列的探針識(shí)別，通過(guò)探針的不同熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)區(qū)分。IC的作用

監(jiān)控PCR反應(yīng)，避免樣本抑制物、DNA（RNA）提取過(guò)程的丟失、誤操作等造成的假陰性結(jié)果；并對(duì)以上原因造成的定量誤差進(jìn)行修正。目前二十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部?jī)?nèi)標(biāo)工作原理圖目前三十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光PCR

在臨床診斷上的應(yīng)用目前三十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光定量PCR的臨床應(yīng)用早期診斷病情評(píng)估和預(yù)后判斷抗病毒藥物療效的觀(guān)察、指導(dǎo)新藥驗(yàn)證輸血源的篩選母嬰傳播的控制與觀(guān)察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷目前三十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部疾病的早期診斷免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測(cè)存在較長(zhǎng)的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均長(zhǎng)達(dá)70天，不利于對(duì)疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測(cè)病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測(cè)顯然也有利于疾病的早期診斷。目前三十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部HBVDNA與血清免疫學(xué)的關(guān)系HBVDNA與HBsAg/HBsAb的關(guān)系

HBsAg（+）HBVDNA（-）：病毒基因的整合，此時(shí)只能表達(dá)HBsAg，而沒(méi)有DNA的復(fù)制；操作失誤；PCR試劑的靈敏度不夠。

HBsAg（-）HBVDNA（+）：“窗口期”；HBsAg的水平過(guò)低無(wú)法檢出，或者HBsAg確已消失但病毒仍處于低水平復(fù)制狀態(tài)；暴發(fā)性乙肝以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg；S區(qū)基因發(fā)生逃避免疫變異造成HBsAg陰性而HBVDNA陽(yáng)性；血清亞型的漏檢；老年人HBsAg檢出率低于5%，

HBsAb（+）通常表示病毒已清除。但已有報(bào)道HBsAb出現(xiàn)后血清內(nèi)仍有DNA復(fù)制，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb與HBVDNA同時(shí)陽(yáng)性，但通常HBVDNA檢出率逐步下降HBVDNA與HBeAg/HBeAb的關(guān)系

HBeAg陽(yáng)性與HBVDNA有顯著相關(guān)。HBeAg陰轉(zhuǎn)往往是HBV病毒血癥的消失或炎癥的靜息。通常認(rèn)為HBeAg轉(zhuǎn)陰繼而出現(xiàn)HBe抗體的轉(zhuǎn)化為乙型慢性肝炎好轉(zhuǎn)穩(wěn)定的標(biāo)志。事實(shí)上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg陰轉(zhuǎn)并不意味著炎癥活動(dòng)的停止。HBeAg陰性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg的表達(dá)為主，感染起始即為HBeAg陰性。目前三十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部病毒感染窗口期的NAT檢測(cè)目前三十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部Lametal-Hepatol26:226,1997對(duì)病毒感染的藥物治療中，免疫學(xué)指標(biāo)的變化通常比較滯后出現(xiàn)，且受個(gè)體差異影響較大，從而對(duì)臨床判斷難以及時(shí)提供直接證據(jù)；而熒光定量PCR檢測(cè)可直接反映病原體滴度是否受藥物治療發(fā)生變化，從而為藥物療效觀(guān)察提供直接依據(jù)，以供治療方案參考。同時(shí)對(duì)不同治療時(shí)間的用藥劑量和用藥時(shí)間提供依據(jù)。抗病毒藥物療效的觀(guān)察、指導(dǎo)目前三十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部如HBV：根據(jù)《2000年拉米夫定臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見(jiàn)》，中國(guó)慢性乙肝病人治療的主要目的就是降低血清HBVDNA，誘導(dǎo)HBeAg血清轉(zhuǎn)換等。HIV:目前用于治療艾滋病的藥物中主要就是抗病毒類(lèi)藥物，因此，HIVRNA滴度的定量測(cè)定與抗HIV藥物治療及療效有著直接的關(guān)系。目前三十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部乙型肝炎患者抗病毒藥物治療前后的HBV滴度比較目前三十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部新藥驗(yàn)證

任何一種抗病毒藥物，以免疫標(biāo)志物來(lái)評(píng)價(jià)其療效均不夠敏感和及時(shí)，若以病毒復(fù)制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和動(dòng)態(tài)變化來(lái)評(píng)價(jià)療效，則較為直接和理想。目前三十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部拉米夫定抑制血清HBVDNA0-20-40-60-80-100治療周數(shù)拉米夫定安慰劑血清HBVDNA;中位%變化0481216202428323640444852n=192n=404n=171n=359III期臨床研究的綜合數(shù)據(jù)目前四十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部病情評(píng)估和預(yù)后判斷通過(guò)定量檢測(cè)病毒滴度可以間接評(píng)估受侵器官或組織的炎癥發(fā)生程度以及是否發(fā)生病變；長(zhǎng)時(shí)間機(jī)體病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往預(yù)后不好。因此對(duì)病原體的定量PCR檢測(cè)對(duì)病情和預(yù)后評(píng)估均有參考意義。目前四十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部遺傳疾病的早期診斷熒光PCR可實(shí)現(xiàn)對(duì)點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測(cè)。對(duì)產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。目前四十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部母嬰傳播的監(jiān)控

熒光PCR可對(duì)病原體的母嬰傳播進(jìn)行有效的監(jiān)控，為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺乳期感染等提供依據(jù)，為母嬰傳播的阻斷等提供參考。目前四十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部腫瘤的診斷熒光PCR的作用：可對(duì)原癌基因的突變和易位等作出檢測(cè)?？蓪?duì)原癌基因的mRNA進(jìn)行定量分析。有利于腫瘤的早期診斷，甚至癌前診斷。探索癌變發(fā)生機(jī)理的研究提供參考。區(qū)別腫瘤的良性和惡性以及炎癥反應(yīng)。目前四十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部結(jié)核病及性病等核酸檢測(cè)意義病原體的檢測(cè)在臨床上通常采用鏡檢、培養(yǎng)等方法。鏡檢法操作簡(jiǎn)便，易造成假陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)靈敏度較低。培養(yǎng)方法要求高，耗時(shí)，不利于臨床上的及時(shí)診斷和用藥。熒光PCR方法具高靈敏度，速度快。不能培養(yǎng)PCR是唯一確診手段（例如HPV）目前四十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR污染及預(yù)防對(duì)策

目前四十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部污染原因

標(biāo)本間交叉污染PCR試劑的污染PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染目前四十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部污染的監(jiān)測(cè)

對(duì)照試驗(yàn)

試劑空白對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照

陰性對(duì)照

重復(fù)性試驗(yàn)

目前四十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十九點(diǎn)深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR防污染措施實(shí)驗(yàn)環(huán)境的控制

PCR應(yīng)實(shí)行嚴(yán)格的分區(qū)操作：前準(zhǔn)備區(qū)；