HIV感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

HIV感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)常用HIV病原學(xué)檢測(cè)方法:病毒分離抗原檢測(cè)核酸檢測(cè)（cDNA測(cè)定-PCR、RNA測(cè)定-病毒載量）其他方法：逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定、原位雜交常用HIV抗體檢測(cè)方法:

ELISA

快速HIV檢測(cè)免疫印記法（WesternBlot）其他方法：免疫熒光法（IFA）、放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)?zāi)壳耙豁揬總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)抗原檢測(cè)的目的（一）檢測(cè)早期感染，縮短窗口期（可提前1-2周）HIV-P24抗原陽性僅作為HIV感染窗口期的輔助診斷依據(jù)，不能據(jù)此確診目前二頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（二）新生兒的感染

嬰幼兒HIV抗體陽性不能用于診斷感染HIV嬰幼兒體內(nèi)從母親得到的HIV抗體持續(xù)存在時(shí)間最長(zhǎng)不超過18個(gè)月。在18月齡以前可以用多種不同的非抗體依賴性的檢驗(yàn)方法對(duì)新生兒HIV感染進(jìn)行輔助診斷，包括：HIVP24抗原檢測(cè)、病毒分離培養(yǎng)、RNA或DNA測(cè)定。18月齡以前嬰幼兒感染HIV診斷要結(jié)合臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室綜合診斷。目前三頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)抗體檢測(cè)的目的輸血和移植安全（為了接受者的安全）監(jiān)測(cè)(為了知曉人群流行狀況)臨床HIV疾病的診斷

(為了知曉個(gè)體感染狀況）

為了達(dá)到以上的某個(gè)目的的HIV

檢測(cè)可能不適合其他目的，比如輸血服務(wù)的檢測(cè)不適合臨床診斷HIV感染目前四頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)HIV抗體檢測(cè)

HIV抗體檢測(cè)分為篩查試驗(yàn)（包括初篩和復(fù)檢）和確認(rèn)試驗(yàn)（WB)。（一）檢測(cè)試劑篩查試劑必須是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)、批檢合格、臨床評(píng)估質(zhì)量?jī)?yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑。目前常用的篩查試劑有酶聯(lián)免疫、顆粒凝集和其它快速診斷試劑。采供血機(jī)構(gòu)進(jìn)行血液篩查應(yīng)采用HIV-1/2混合型酶聯(lián)免疫試劑。自采自供血的單位必須進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)。目前五頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（二）篩查方法1.

常用的篩查方法是酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）目前國(guó)內(nèi)外主要使用第三代（雙抗原夾心法）試劑，少數(shù)使用第二代試劑。血源篩查仍以第三代ELISA為主，國(guó)際上有些國(guó)家和地區(qū)已將線性免疫酶測(cè)定（第四代ELISA試劑）用于血源篩查。第四代ELISA試劑是最近發(fā)展起來的HIV抗原抗體聯(lián)合測(cè)定試劑，可同時(shí)檢測(cè)P24抗原和抗HIV-1/2抗體。與第三代抗HIV-1/2試劑相比，檢出時(shí)間提前了4-9.1d。其優(yōu)點(diǎn)在于能同時(shí)檢測(cè)抗原抗體，降低血源篩查的殘余危險(xiǎn)度。目前六頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗體或抗原的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。目前七頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)ELISA的原理

用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。目前八頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)ELISA的原理加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。目前九頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)ELISA的類型

雙抗原夾心法測(cè)抗體

雙抗體夾心法測(cè)抗原

間接法測(cè)抗體

競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲包被法等目前十頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)雙抗原夾心法測(cè)抗體將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。加酶標(biāo)抗原，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合，徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗原。加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測(cè)知標(biāo)本中抗體的量。目前十一頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)包被了HIV抗原的檢測(cè)板患者的抗體酶顯色劑+ve-ve酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)HIV

檢測(cè)的介紹ELISA目前十二頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)ELISA板質(zhì)控陽性陰性?結(jié)果IntroductiontoHIVTestingModule1SubModule3–PPT02目前十三頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)

2、快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)

隨著對(duì)HIV感染者和AIDS病人抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的進(jìn)展，及對(duì)無癥狀HIV感染者提供自愿咨詢檢測(cè)（VCT）的迫切需求，簡(jiǎn)便、快速的HIV檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用。常用的主要有以下幾種：（1）明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）：PA是HIV血清抗體檢測(cè)的一種簡(jiǎn)便方法，是將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用，混勻后保溫（一般為室溫）。當(dāng)待檢樣品含有HIV抗體時(shí)，經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA試劑（AFDHIV-1/2PA），已經(jīng)我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）注冊(cè)批準(zhǔn)；HIV-1、HIV-2抗原分別致敏的PA試劑（SERODIA-HIV-1/2）可初步區(qū)分HIV-1型和HIV-2型，目前我國(guó)尚未引進(jìn)。目前十四頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)PA原理示意圖目前十五頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（PA）檢測(cè)結(jié)果的判定目前十六頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（2）斑點(diǎn)EIA或稱斑點(diǎn)ELISA（dot-EIA）：以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點(diǎn)狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10min以內(nèi)，使用抗原量少。目前十七頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（3）斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)金標(biāo)紙條采用雙抗原夾心法免疫測(cè)定原理，選擇經(jīng)純化的基因工程制備的gp36、gp41、p24抗原作為包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作為膠體金結(jié)合抗原。當(dāng)待檢標(biāo)本中含有HIV抗體時(shí)，先和金標(biāo)記抗原結(jié)合，由于層析作用反應(yīng)復(fù)合物沿硝酸纖維膜向前移動(dòng)，當(dāng)遇到包被抗原時(shí)，形成Ag-Ab-Ag-Au復(fù)合物而富集在包被線上，形成紅色沉淀線。同時(shí)在包被膜上還有一條質(zhì)控線對(duì)照，故當(dāng)有兩條紅線時(shí)判為陽性，只有一條紅線時(shí)，判為陰性。

目前十八頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)金標(biāo)法試劑試劑穩(wěn)定，可室溫長(zhǎng)期保存。試驗(yàn)時(shí)不需任何設(shè)備，迅速、簡(jiǎn)便、特異性較好，敏感性約相當(dāng)于中度敏感的ELISA，適用于應(yīng)急檢測(cè)、門診急診個(gè)體檢測(cè)。目前已有在國(guó)內(nèi)被SFDA批準(zhǔn)注冊(cè)的國(guó)外進(jìn)口試劑和國(guó)內(nèi)產(chǎn)品。一般可在1030min內(nèi)判讀結(jié)果。目前十九頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)無反應(yīng)目前二十頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)反應(yīng)目前二十一頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)無意義目前二十二頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)無意義目前二十三頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)無意義目前二十四頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)無意義目前二十五頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)金標(biāo)法（膠體硒法）結(jié)果判定目前二十六頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（4）艾滋病唾液檢測(cè)卡：在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同時(shí)檢測(cè)含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測(cè)唾液中的HIVIgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可避免靜脈穿刺。但樣品預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)且售價(jià)較高。以唾液為樣品測(cè)定HIV抗體的ELISA、免疫印跡法（WB）試劑已經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)。（5）其它快速篩查試驗(yàn)方法：家庭HIV檢測(cè)（HomeAccessSystem）等。目前二十七頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)快速HIV檢測(cè)與常規(guī)HIV檢測(cè)快速* 平均45分鐘 （10分鐘－2.5小時(shí)）常規(guī) 平均3.5小時(shí) （94分鐘－16小時(shí)）*一般不要特殊設(shè)備，試劑可不用冰箱存放目前二十八頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)快速試劑的局限性一般不用于血液篩查（除5年行動(dòng)計(jì)劃）有一定的假陽性反應(yīng)，如作為臨床診斷，要復(fù)檢和確認(rèn)有一定的假陰性反應(yīng)（尤其暴露時(shí)間<3個(gè)月）隨訪檢測(cè)（解釋檢測(cè)前后咨詢必要性）目前二十九頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（三）篩查試驗(yàn)步驟根據(jù)檢測(cè)目的選用符合要求的篩查試劑對(duì)樣品進(jìn)行初篩和重復(fù)檢測(cè)（復(fù)檢）初篩試驗(yàn)：以第三代ELISA（雙抗原夾心法）梅里埃試劑為例。（1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：試驗(yàn)開始前將試劑和樣品放置在室溫(1823℃),按實(shí)驗(yàn)室SOP做好試劑準(zhǔn)備。磷酸鹽緩沖液：若液體內(nèi)有結(jié)晶,應(yīng)放置在37℃直至溶解，用蒸餾水1：25稀釋濃縮液，4℃保存2周。TMB底物液：使用前配制，TMB液和過氧化脲液等量混勻。1M硫酸終止液：85ml蒸餾水中加入5ml濃硫酸。

備好試劑盒、待檢樣品和外部對(duì)照質(zhì)控血清后，按試劑盒說明書以及質(zhì)控和安全防護(hù)要求進(jìn)行篩查檢測(cè)。目前三十頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（2）實(shí)驗(yàn)操作①裝好所需使用數(shù)目的孔條,每孔均加入100μl樣品稀釋液。設(shè)3個(gè)陰性對(duì)照孔，1個(gè)HIV-1陽性對(duì)照孔，若需要可再設(shè)1個(gè)HIV-2陽性對(duì)照孔。②每孔加入50μl待檢樣品及對(duì)照（對(duì)照要后加），未用孔用樣品稀釋液加滿以溶解結(jié)合物球，以免堵塞洗板機(jī)孔?？烧饟u15S，37±2℃孵育60±5min。③置洗板機(jī)上洗滌6遍（用洗液將反應(yīng)孔完全加滿,靜置3060S,共洗滌6遍，洗完后孔上方及底部不應(yīng)殘存液體.）。④每孔加入100μl底物液，勿攪動(dòng)，室溫避光孵育30±2min。⑤每孔加入100μl1M硫酸終止反應(yīng)，充分混勻。⑥在2h內(nèi)置于酶標(biāo)儀讀數(shù)，單波長(zhǎng)450nm，或雙波長(zhǎng)450/630nm測(cè)OD值。目前三十一頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果①陰性對(duì)照（NC），HIV-1陽性對(duì)照（PC1），HIV-2陽性對(duì)照（PC2）NC必須＜0.25方可用，排除NC≥0.25的值，計(jì)算NC平均值。NC界限范圍：0.6倍NC均值＜NC＜1.4倍NC均值。②符合以下條件的實(shí)驗(yàn)成立：兩個(gè)以上的NC可用。PC1-NC均值≥0.4，PC2-NC均值≥0.4③Cutoff值=陰性對(duì)照均值+0.100小于Cutoff為陰性，大于或等于Cutoff為陽性（4）報(bào)告：對(duì)呈陰性反應(yīng)的樣品，可由實(shí)施檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室出具HIV抗體陰性報(bào)告；對(duì)呈陽性反應(yīng)的樣品，須進(jìn)行復(fù)檢，不能出陽性報(bào)告。目前三十二頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)（四）檢測(cè)要點(diǎn)1、篩查試驗(yàn)陽性不能出陽性報(bào)告2、嚴(yán)格按照試劑說明書操作，不得擅自更改。3、注意防止交叉污染。4、嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）。

（五）檢測(cè)程序及流程圖1、篩查試驗(yàn)標(biāo)本驗(yàn)收合格后，用篩查試劑進(jìn)行檢測(cè)，如呈陰性反應(yīng)，報(bào)告HIV抗體陰性；對(duì)呈陽性反應(yīng)的標(biāo)本，須進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。目前三十三頁\總數(shù)三十六頁\編于十三點(diǎn)2、重復(fù)檢測(cè)

對(duì)篩查呈陽性反應(yīng)的標(biāo)本用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的試劑重復(fù)檢測(cè)。如兩種試劑復(fù)測(cè)均呈陰性反應(yīng)，則報(bào)告HIV抗體陰性；如均呈陽性反應(yīng)，或一陰一陽，需送艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)。應(yīng)盡可能將重新采集的受檢者血液標(biāo)本和原有