FACSCanto流式細胞儀原理

BD公司介紹BD公司是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在紐約創(chuàng)立的,總部位于美國新澤西州目前一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點BD公司介紹位居財富周刊500強的大型跨國公司產(chǎn)品涵蓋諸多醫(yī)療領(lǐng)域生物科學(xué)部:流式細胞儀及應(yīng)用于生物科學(xué)的試劑、耗材目前二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點BD公司流式細胞儀產(chǎn)品FACSVantageSE-大型分選機FACSAria-高速分選的臺式機FACSDiva-高速分選的數(shù)字化大型機目前三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點BD公司流式細胞儀產(chǎn)品FACSCount流式細胞儀FACSCalibur流式細胞儀FACSCantoII流式細胞儀目前四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點BD公司流式細胞儀產(chǎn)品BDFACSCantoII流式細胞儀目前五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoII流式細胞儀原理目前六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點流式細胞儀可告訴我們一個細胞的什么指標(biāo)?細胞的相對大?。ㄇ跋蚪巧⑸涔庑盘?，F(xiàn)SC）細胞的相對顆粒性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性（側(cè)向散射光信號，SSC）相關(guān)的熒光強度目前七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點散射光信號的特征FSC和SSC當(dāng)顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。與激光束垂直的稱為側(cè)向角散色光信號（SSC）。488nm激光激發(fā)產(chǎn)生散射光目前八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點前向角散射光信號FSC目前九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點側(cè)向角散射光信號SSC目前十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點散射光信號的特征紅細胞裂解的全血目前十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點熒光信號的特征什么是熒光信號當(dāng)熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過激光束時，染料吸收光子躍遷到高能級，返回基態(tài)時，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。這種發(fā)射出的光稱為熒光。目前十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點熒光信號的特征發(fā)射光的熒光強度與結(jié)合的位點成正比目前十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點信號產(chǎn)生熒光信號目前十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點熒光信號的特征常見熒光染料的發(fā)射波長目前十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點直方圖顯示熒光信號目前十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點點圖顯示熒光信號目前十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點什么是流式細胞儀？在流動的狀態(tài)中檢測細胞各種物理及生物特征的一種儀器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid目前十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點流式細胞儀特點及檢測標(biāo)本特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細針穿刺，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液目前十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoII流式細胞儀系統(tǒng)組成流式細胞儀液流車工作站目前二十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCanto簡介配置空冷激光兩根激光:488nm、633nm、光路固定，無需調(diào)校液流系統(tǒng)信號檢測系統(tǒng)八角形和三角形光學(xué)收集系統(tǒng)，將光信號轉(zhuǎn)換成電信號電子系統(tǒng)將電信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字化信號目前二十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點液流系統(tǒng)流動室鞘液工作液，可選PBS、血球稀釋液或蒸餾水。樣本流單細胞懸液，濃度51051106/mL目前二十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點液流系統(tǒng)鞘液是壓力驅(qū)動的。在壓力作用下，鞘液經(jīng)過濾器進入流動室下部的小室中。檢測的樣本在壓力的作用下，也進入流動室下部的小室中，樣本壓力略大于鞘液的壓力。在鞘液的包裹下，樣本由下向上通過流動室，經(jīng)激光激發(fā)后，樣本中的顆粒被檢測。目前二十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點液流系統(tǒng)

-FLOWCELL(流動室)InjectorTip熒光信號聚焦的激光光束鞘液目前二十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點液流系統(tǒng)目前二十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點液流系統(tǒng)-樣本流速目前二十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點樣本流速的選擇高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：一般用于對分辨率要求較高的分析，如DNA分析。目前二十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點光學(xué)系統(tǒng)目前二十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點光學(xué)系統(tǒng)染色的細胞或其他顆粒通過聚焦的激光束時，會散射激光或熒光。因為激光束是一個小斑點，顆?？焖偻ㄟ^流動室，散射光或熒光持續(xù)的時間非常短-只有幾微秒。這些短暫的光信號被收集、過濾然后被檢測器轉(zhuǎn)換成電信號。目前二十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點信號采集系統(tǒng)激光488nm，633nm，激發(fā)樣本中的顆?；蚣毎a(chǎn)生散射光信號和熒光信號信號檢測組件-八角形和三角形光學(xué)濾片將激光激發(fā)后產(chǎn)生的散射光信號和熒光信號引導(dǎo)至相應(yīng)的PMTPMT-將光信號轉(zhuǎn)換成電信號目前三十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色PerCP 488 670免疫熒光深紅APC633 670免疫熒光紅色PI488620DNA染色

橙紅ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅目前三十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點

常用熒光染料(488nm,633nm激發(fā))FluoresceinIsothiocyanate(FITC)異硫氰酸熒光素Phycoerythrin(PE)藻紅素Allophycocyanin(APC)異藻藍蛋白Peridinin-ChlorophyllProtein(PerCP)多甲藻黃素-葉綠素蛋白TandemDyesPE-TexasRed(ECD)PE-Cy5(PC5)PE-Cy5.5(PC5.5)(futures)PE-Cy7(PC7)(futures)目前三十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ信號檢測組件種類八角形三角形構(gòu)成檢測器濾片目前三十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ信號檢測組件八角形檢測組件目前三十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ信號檢測組件三角形檢測組件目前三十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ信號檢測組件檢測器鞘液流中的顆粒通過激光束時會產(chǎn)生光信號，光信號到達檢測器生成電脈沖信號，電子系統(tǒng)對電脈沖信號進一步處理。FACSCanto兩類檢測器光電二極管：FSC光電倍增管PMT：SSC和熒光信號目前三十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ信號檢測組件光學(xué)濾片用于調(diào)整光譜的分布。當(dāng)光子遇到濾片時，光子或通過濾片，或被濾片吸收，或被濾片反射。目前三十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ的濾片長通濾片（LP）：長于設(shè)定波長的光通過，并反射短于設(shè)定波長的光目前三十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ的濾片帶通濾片：允許一定帶寬波長的光通過。目前三十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ的濾片目前四十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ的濾片目前四十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點FACSCantoⅡ電子系統(tǒng)將與電脈沖信號強弱相關(guān)的電壓數(shù)字化有三類電脈沖信號高度信號H面積信號A寬度信號W目前四十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點幾個概念信號放大PMT將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，調(diào)整PMT的電壓，信號強度將隨之改變。閾值信號放大過程會產(chǎn)生不需要的脈沖信號，通常來自于碎片。通過設(shè)定某一信號的最低強度值，可將不需要的脈沖信號去除，這一設(shè)定值稱為閾值。目前四十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點幾個概念顏色補償采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差。在完成雙色以上熒光標(biāo)記的樣本時，都需要作顏色補償。目前四十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點顏色補償FITC主要由FITC的檢測器檢測，但部分光也會進入PE檢測器目前四十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點幾個概念顏色補償帶通濾片接受的是一定帶寬波長的熒光，故會有干擾光同時被接收，然后一同進入PMT進行光電轉(zhuǎn)換并放大。目前四十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點幾個概念顏色補償通常干擾光占該染料所發(fā)出熒光總量的X%目前四十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點

補償模型圖

目前四十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點顏色補償判斷標(biāo)準

未作顏色補償目前四十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點顏色補償判斷標(biāo)準

補償后目前五十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點怎樣進行顏色補償CompBeads用于流式細胞儀多色分析時調(diào)整熒光補償。含兩種微球，抗小鼠/大鼠免疫球蛋白鏈的微球，可與小鼠/大鼠免疫球蛋白的鏈結(jié)合；及陰性對照微球，不與免疫球蛋白結(jié)合。這兩種微球與鼠源性的熒光抗體混合時，顯示為清晰的陽性群與陰性群（背景熒光），可據(jù)此手動調(diào)整顏色補償。Anti-MouseIg補償微球組合，產(chǎn)品號：552843Anti-RatIg補償微球組合，產(chǎn)品號：552844Anti-Rat/hamsterIg補償微球組合，產(chǎn)品號：552845目前五十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點儀器運作需要的質(zhì)控品儀器校準需要微球BDFACS7-ColorSetupBeads（CatNo.335775）補償調(diào)整需要微球BDCompBeadsAnti-MouseIg,(CatNo.552843)BDCompBeadsAnti-RatIg,(CatNo.552844)儀器清潔BDFACSRinse漂白水目前五十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點流式細胞儀的應(yīng)用目前五十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點流式細胞儀可以告訴我們什么？目前五十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞內(nèi)和細胞外發(fā)生了什么事件？目前五十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點流式細胞術(shù)的應(yīng)用細胞生理學(xué)研究細胞膜表面標(biāo)記胞內(nèi)標(biāo)記細胞周期分析凋亡分析分選CBA目前五十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究細胞相對大小和顆粒性胞內(nèi)pH值檢測Ca++流動性檢測膜電勢檢測細胞活性檢測細胞活力(增殖能力)的檢測目前五十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究細胞相對大小和顆粒性分析目前五十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究胞內(nèi)pH值的檢測目前五十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究Ca2+流動性檢測Ca2+是非常重要的細胞內(nèi)離子，在胞膜到胞漿的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。細胞受到刺激后，胞內(nèi)Ca2+濃度會發(fā)生改變。最常用的染料Indo-1excitedatUVFluo-3excitedat488nmFuraredexcitedat488nm目前六十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究Ca2+流動性檢測目前六十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究細胞膜電位的改變超極化的細胞攝取更多的染料，細胞總的熒光強度增大；細胞去極化時，染料釋放到細胞外，總的熒光強度減少。染料和試劑DiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)ValinomycinGramicidinDCCCP目前六十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究細胞膜電位的改變目前六十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究細胞活性分析

FluoresceinDiacetate進入活細胞后,被胞內(nèi)酯酶降解,生成熒光底物.活細胞會發(fā)綠色熒光目前六十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究細胞活力分析CFSE(CarboxyfluoresceinSuccinimidylester)是一種親脂性染料，可被細胞膜吸收。細胞標(biāo)記CFSE后再誘導(dǎo)增殖，分裂后的細胞將含半量的CFSE，如此可監(jiān)控細胞分裂的數(shù)目。目前六十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞生理學(xué)研究細胞活力分析上圖中人T細胞被標(biāo)記并刺激后，可跟蹤六代的分裂。如果配合使用Modfit軟件分析，可確定每代的細胞數(shù)。目前六十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞膜表面標(biāo)記CD2CD4CD#=clusterdesignationnumber目前六十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點細胞內(nèi)標(biāo)記胞內(nèi)多種肽類已被成功標(biāo)記，包括病毒顆粒、免疫球蛋白、雌激素受體、細胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cycl