常用的微生物分離純化方法

------------------------------------------------------------------------常用的微生物分離純化方法(一)常用的微生物分離純化方法

菌種分離純化的方法有：稀釋混合倒平板法、稀釋涂布平板法、平板劃線分離法、稀釋搖管法、液體培養(yǎng)基分離法、單細(xì)胞分離法、選擇培養(yǎng)分離法等。其中前三種方法最為常用,不需要特殊的儀器設(shè)備,分離純化效果好,現(xiàn)分別簡述如下

1.稀釋混合倒平板法

平板是指經(jīng)熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中,冷卻凝固而成的盛有固體培養(yǎng)基的平皿。該法是先將待分離的含菌樣品,用無菌生理鹽水作一系列的稀釋(常用十倍稀釋法,稀釋倍數(shù)要適當(dāng)),然后分別取不同稀釋液少許(0.5-1.0ml)于無菌培養(yǎng)皿中,傾入已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基,迅速旋搖,充分混勻。待瓊脂凝固后,即成為可能含菌的瓊脂平板。

于恒溫箱中倒置培養(yǎng)一定時間后,在瓊脂平板表面或培養(yǎng)基中即可出現(xiàn)分散的單個菌落。每個菌落可能是由一個細(xì)胞繁殖形成的。挑取單一個菌落,一般再重復(fù)該法1-2次,結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征,便可得到真正的純培養(yǎng)物。若樣品稀釋時能充分混勻,取樣量和稀釋倍數(shù)準(zhǔn)確,則該法還可用于活菌數(shù)測定。

圖4混合倒平板操作法示意圖圖5涂布平板操作法示意圖

2.稀釋涂布平板法

采用上述稀釋混合倒平板法有兩個缺點(diǎn)，一是會使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間,缺乏溶氧而生長受影響,形成的菌落微小難于挑?。灰皇窃趦A入熔化瓊脂培養(yǎng)基時，若溫度控制過高,易燙死某些熱敏感菌，過低則會引起瓊脂太快凝固,不能充分混勻。

在微生物學(xué)研究中,更常用的純種分離方法是稀釋涂布平板法。該法是將已熔化并冷卻至約50℃(減少冷凝水)的瓊脂培養(yǎng)基,先倒入無菌培養(yǎng)皿中,制成無菌平板。待充分冷卻凝固后,將一定量(約0.1ml)的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面,再用三角形無菌玻璃涂棒涂布,使菌液均勻分散在整個平板表面,倒置溫箱培養(yǎng)后挑取單個菌落。

另一種簡單快速有效的涂布平板法,可省去含菌樣品懸液的稀釋,直接吸取經(jīng)振蕩分散的樣品懸浮液l滴加入1號瓊脂平板上,用一支三角形無菌玻璃涂棒均勻涂布,用此涂棒再連續(xù)涂布2號、3號、4號平板(連續(xù)涂布起逐漸稀釋作用，涂布平板數(shù)視樣品濃度而定),翻轉(zhuǎn)此涂棒再涂布5號、6號平板,經(jīng)適溫倒置培養(yǎng)后挑取單個菌落。該法可稱之為玻璃涂棒連續(xù)涂布分離法。

3.平板劃線分離法

先倒制無菌瓊脂培養(yǎng)基平板,待充分冷卻凝固后,用接種環(huán)以無菌沾取少量待分離的含菌樣品,在無菌瓊脂平板表面進(jìn)行有規(guī)則的劃線。劃線的方式有連續(xù)劃線、平行劃線、扇形劃線或其它形式的劃線。通過這樣在平板上進(jìn)行劃線稀釋,微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少,并逐步分散開來。經(jīng)培養(yǎng)后,可在平板表面形成分散的單個菌落。但單個菌落并不一定是由單個細(xì)胞形成的，需再重復(fù)劃線1-2次,并結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征,才可獲得真正的純培養(yǎng)物。該法的特點(diǎn)是簡便快速。

圖6平板劃線分離操作法示意圖

個體細(xì)胞的生長難以測定,而且生長與繁殖是交替進(jìn)行的,因此，微生物的生長繁殖一般不是依據(jù)個體細(xì)胞的大小,而是以群體細(xì)胞數(shù)目的增加作為指標(biāo)的。測定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多,主要有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法、光電比濁法、最大可能數(shù)(MPN)法、膜過濾法等。

測定酵母細(xì)胞數(shù)或霉菌孢子數(shù)常采用在顯微鏡下直接進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法,該計(jì)數(shù)方法被廣泛應(yīng)用于酒精、啤酒和白酒等的工業(yè)化生產(chǎn)中。

平板菌落計(jì)數(shù)法被廣泛應(yīng)用于食品、飲品、水質(zhì)和活菌制劑等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。該計(jì)數(shù)方法又稱平板活菌計(jì)數(shù)法,其最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌數(shù)的信息。但是,該計(jì)數(shù)法操作過程較繁,需要培養(yǎng)一定時間才有結(jié)果,且測定結(jié)果易受多種因素的影響。

光電比濁計(jì)數(shù)法是采用光電比色計(jì)或分光光度計(jì),測定菌懸液的光密度或透光度,其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速,可以連續(xù)測定,適合于自動控制。但該法除了受菌體濃度影響外,還受細(xì)胞形態(tài)、大小、培養(yǎng)液成分及所采用光波長等因索的影響。

(一)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

該法是將酵母菌或霉菌孢子懸液,放在血球計(jì)數(shù)器載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下直接進(jìn)行計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。

Thoma血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚載玻片,玻片的中間部分刻有四條溝槽,形成三個平臺。中間的平臺較寬且比兩邊的平臺略低,其中央刻有一小方格網(wǎng)的計(jì)數(shù)區(qū),計(jì)數(shù)區(qū)的面積為l平方毫米。另一種計(jì)數(shù)器中間平臺的中間又被一短的橫溝槽分為兩半,成為兩個小平臺,每個小平臺上面各刻有一個計(jì)數(shù)區(qū),共有兩個計(jì)數(shù)區(qū)。當(dāng)蓋上特定蓋玻片時,蓋玻片與計(jì)數(shù)室的空間厚度正好是0.l毫米,這樣計(jì)數(shù)室的體積為0.l立方毫米,即0.000l毫升。計(jì)數(shù)室有兩種刻度形式,一種是全區(qū)分16大格,每大格再分25小格,一共400小格。另一種是全區(qū)分25大格,每大格再分16小格,也是400小格。

計(jì)數(shù)時,可將酵母菌液(或孢子懸液)充滿計(jì)數(shù)室,在顯微鏡下按規(guī)定數(shù)4個或5個大格的總細(xì)胞數(shù),再求得每小格內(nèi)平均的細(xì)胞數(shù),即可計(jì)算出每ml培養(yǎng)液中的細(xì)胞總數(shù)。

每ml菌液酵母菌細(xì)胞數(shù)=每小格平均酵母細(xì)胞數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)。

(二)平板菌落計(jì)數(shù)法

該法的基本原理是：將待測含菌樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋,使其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞,然后取一定量的稀釋樣品液,接種到平板上。經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后,由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的單菌落,即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個活菌。最后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù),根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣量,換算出單位樣品中所含的活菌數(shù)。

實(shí)際上，由于待測樣品不易完全分散成單個細(xì)胞,故所形成的菌落并非都是單菌落,有一部分是由2個以上的細(xì)胞長成的,因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果會比實(shí)際偏低?，F(xiàn)在已采用菌落形成單位(cfu)來表示樣品的活菌含量。

(三)光電比濁計(jì)數(shù)法

光電比濁計(jì)數(shù)法的原理是：光線透過菌懸液時,其透光率與細(xì)胞濃度成反比,而光密度與細(xì)胞濃度成正比。透光率或光密度可以由光電池精確測出(光波通常選