化妝品舒緩功效-斑馬魚胚胎中性粒細(xì)胞測試方法（征求意見稿）

ICS：71.100.70Y40T/HPCIA00X-2022化妝品舒緩功效-斑馬魚胚胎中性粒細(xì)胞測試

方法SoothingEfficacyofCosmetics-ZebrafishNeutrophilTestMethod（征求意見稿）2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX實施廣州開發(fā)區(qū)黃埔化妝品產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布#前言TOC\o"1-5"\h\z范圍 3\o"CurrentDocument"規(guī)范性引用文件 3\o"CurrentDocument"術(shù)語和定義 3原理 3儀器設(shè)備 3\o"CurrentDocument"主要試劑及耗材 4實驗方法 ] 5受試物準(zhǔn)備 ;：????，； 6測試步驟 廳 6結(jié)果計算 N 7\o"CurrentDocument"測試有效性驗證 二 7結(jié)果相關(guān)性解讀??…'g ，? 7結(jié)果報告?…二 :. 7附錄A（資料性附錄）??…土 ?' 尹 9附錄B（資料性附錄） ?盤2 子 10參考文獻(xiàn) 11r/ —冃IJ 言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》規(guī)則起草。本文件由廣東省開發(fā)區(qū)黃埔化妝品產(chǎn)業(yè)協(xié)會提出。本標(biāo)準(zhǔn)由廣州開發(fā)區(qū)黃埔化妝品產(chǎn)業(yè)協(xié)會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：化妝品舒緩功效一斑馬魚胚胎中性粒細(xì)胞測試方法1范圍本文件規(guī)定了斑馬魚胚胎中性粒細(xì)胞測試方法的基本要求。本文件提供一種化妝品舒緩功效的斑馬魚生物評估方法，適用于測試通過有效抑制中性粒細(xì)胞聚集而達(dá)到舒緩效果的原料及配方的功效評價。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡未注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和測試方法DB32/T3979-2021實驗用斑馬魚飼育技術(shù)條件OECDTG236-2013化學(xué)品測試規(guī)范斑馬魚胚胎急性毒性測試ISO15088-2017污水對斑馬魚胚胎的主性毒性測試3術(shù)語和定義下列術(shù)語及定義適合于本文件。3.1斑馬魚胚胎Zebrafishembryo處在依靠卵黃提供能量發(fā)育階段的斑馬魚胚胎。3.2沒有心跳Lackofheartbeat一分鐘內(nèi)心臟沒有跳動的魚胚胎。3.310%致死濃度10%LethaIconcentration,LC10受試物導(dǎo)致10%受試魚胚胎死亡的濃度。魚胚胎沒有心跳則判定為死亡。4原理皮膚在收到刺激或病菌入侵時，會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，會出現(xiàn)紅腫、瘙癢等不適，表現(xiàn)出敏感肌征兆。其中，中性粒細(xì)胞是最主要的免疫白細(xì)胞，作用于吞噬和清除皮膚中的感染或有害物質(zhì)。而斑馬魚胚胎的中性粒細(xì)胞和人體中性粒細(xì)胞在形態(tài)、生化和生理功能上高度相似，因此斑馬魚測試結(jié)果對人體皮膚功效具有很好的可推導(dǎo)性。應(yīng)用硫酸銅誘導(dǎo)斑馬魚胚胎側(cè)線區(qū)域神經(jīng)丘細(xì)胞損傷而引起中性粒細(xì)胞聚集的模型進(jìn)行測試，比較受試物處理組和模型對照組的魚胚胎側(cè)線區(qū)域的中性粒細(xì)胞的數(shù)量變化,計算中性粒細(xì)胞抑制率以評價原料、配方或產(chǎn)品的舒緩功效。5儀器和設(shè)備5.1斑馬魚養(yǎng)殖設(shè)備設(shè)備需配有溫控裝置，水循環(huán)和過濾裝置，養(yǎng)殖容器用玻璃或常見食品級PC材質(zhì)制成?？刹捎猛ㄓ冒唏R魚養(yǎng)殖設(shè)備或按實驗室需求配備魚缸（如長寬高45cmX45cmX30cm）。5.2產(chǎn)卵盒/缸由玻璃、不銹鋼或其它惰性材料制成，配備網(wǎng)篩（網(wǎng)格大小為2mmX2mm,由不銹鋼或多項材料組成用來保護(hù)魚卵）。5.3水質(zhì)監(jiān)測設(shè)備pH計、溶解氧測定儀、鹽度計（電導(dǎo)率測定儀）。5.4分析天平精度0.Img。5.5顯微鏡配帶照相系統(tǒng)，最大放大倍數(shù)應(yīng)大于80倍的體式顯微鏡。方法A中顯微鏡需配帶綠色熒光。5.6測試容器測試容器：玻璃或聚苯乙烯測試容器（如96-孔板，培養(yǎng)皿）。如測試物可能吸附于聚苯乙烯容器時（如非極性化學(xué)品），應(yīng)選用惰性材料（如玻璃）來減少吸附。5.7恒溫箱精度±l°Co5.8豐年蝦孵化器設(shè)備需配有孵化桶，氣管，氣量調(diào)節(jié)閥，氣泵截止開關(guān)和止逆閥裝置。9其他常規(guī)測試儀器和設(shè)備移液管、離心管、玻璃容器（如燒杯、容量瓶等）、旋渦混合紘超聲水拾鍋、離心機(jī)、低溫冰箱、可調(diào)節(jié)移液器和吸頭。6主要試劑與耗材1水符合GB/T6682規(guī)定。6.2甲醇、二甲基亞硯、乙醇等助溶劑分析純級別。6.3親魚養(yǎng)殖用水稱取4g海鹽溶于10L水配制而成，鹽度為0.25-0.50%。，電導(dǎo)率為500?800卩S/cm,溶解氧＞80%飽和度，pH值6.5?8.5,硬度30?300mg/L（以碳酸鈣計）。6.4豐年蝦（Artemiasalina）卵豐年蝦休眠卵需干燥避光冷藏。稱取約15g海鹽溶于1L水配制豐年蝦卵孵化水，密度以不超過4g/L豐年蝦卵為宜。6.5魚胚胎培養(yǎng)液稱取2940mg無水氯化鈣，1233mg七水硫酸鎂，630mg碳酸氫鈉，55mg氯化鉀溶于10L水配制而成。pH值6.5?8.5?；瘜W(xué)品均為分析純級別。采用B法測試需要準(zhǔn)備下列6.6-6.14試劑。6.6硫酸銅溶液用水配制160mg/L五水硫酸銅（CuSO4-5H2O）儲存液。室溫儲存。工作液濃度為0.16mg/L,用魚胚胎培養(yǎng)液稀釋，使用前新鮮配制。6.7吲哚美辛溶液用二甲基亞硯配制36mg/L哼噪美辛儲存液。冷藏。工作液濃度為0.0036mg/L哼噪美辛，用魚胚胎培養(yǎng)液稀釋，使用前新鮮配制。6.8多聚甲醛用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）配制含有4%多聚甲醛和0.8%氫氧化鈉（NA0H）,pH為7.2?7.4的溶液。冷臧。6.950%和70%酒精溶液用水配制50%和70%酒精溶液。6.10蘇丹黑染色液蘇丹黑儲存液：用70%酒精配制0.4%蘇丹黑儲存液。冷藏。苯酚溶液：將8g苯酚溶節(jié)15mL乙醇溶液，將0.3gM^04-12H20溶解于50mL水中，然后將二種溶液混合配制成苯酚溶液。室溫儲存，半年內(nèi)有效。蘇丹黑染色液是將900皿70%酒精溶液，100皿蘇丹黑儲存液和1應(yīng)苯酚溶液混合而成。用前新鮮配制。6.11PBST配制0.04%TritonXT00于PBS溶液中。室溫儲存。6.12漂白溶液用水配制含有3%H202和1%K0H的溶液。使用前新鮮配制。6.13清透液1用水配制含有20%甘油和0.25%K0H的溶液。室溫保存。6.14清透液2用水配制含有50%甘油和0.25%KOH的溶液。室溫保存。7實驗方法7.1受試生物A法應(yīng)用中性粒細(xì)胞熒光標(biāo)記斑馬魚（Daniorerio）（如：mpo,lyz,mpegl等品系）產(chǎn)卵測試。B法應(yīng)用中性粒細(xì)胞熒光標(biāo)記斑馬魚（Daniorerio），也可以應(yīng)用來源可靠（如中國國家斑馬魚資源中心）的野生型AB品系斑馬魚（Daniorerio）產(chǎn)卵測試。親魚應(yīng)具有較好的繁殖能力-魚齡以6-12月最佳。傳代盡量使用側(cè)交以保持遺傳多樣性，純品系親魚繁殖5代后需更換新一批親魚。親魚不應(yīng)該有明顯可見的感染和疾病特征，且在2個月內(nèi)沒有經(jīng)歷過藥物治療。在繁殖產(chǎn)卵測試前，親魚應(yīng)在引入實驗室后馴養(yǎng)14天以上。7.2養(yǎng)殖要求7.2.1養(yǎng)殖水溫宜控制在26-28.5°C,室內(nèi)溫度建議控制在20~25°Co2.2養(yǎng)殖密度宜控制在每升水1?2條魚，以及每日固定的12?16h光照，且需保持良好的過濾系統(tǒng)。7.2.3每天至少喂食2次，包括至少1次豐年蝦（Artemiasalina'）幼蟲，喂食間隔在3小時以上，避免過量喂食影響水質(zhì)和清潔度。3產(chǎn)卵要求7.3.1如用產(chǎn)卵缸收集魚卵，將雄魚和雌夢以2：1的比率為宜在產(chǎn)卵前一天關(guān)燈前1?2h放進(jìn)產(chǎn)卵缸中。由于斑馬魚偶爾不產(chǎn)卵，建議同時準(zhǔn)備多個產(chǎn)卵缸備用。7.3.2為避免基因偏差，將最少3個產(chǎn)卵缸中收集的魚卵混合再進(jìn)行挑選備用。若用養(yǎng)殖魚缸收集魚卵,收卵盒在產(chǎn)卵前一天關(guān)燈前或產(chǎn)卵當(dāng)天開燈前放進(jìn)要收集魚卵的養(yǎng)殖魚缸中。7.3.3為避免魚卵被成魚所食，收卵盒用惰性網(wǎng)覆蓋。7.3.4交配、產(chǎn)卵和受精在開燈后大約30min內(nèi)完成，屆時可把收卵盒移出魚缸。7.3.5魚卵從收卵盒取出后，建議用魚胚胎培養(yǎng)液清潔魚胚胎。7.3.6挑選健康的斑馬魚胚胎；并以200應(yīng)魚胚胎培養(yǎng)液爭不超過1尾魚胚胎的密度于28+TC培養(yǎng)至受精后2天。8受試物準(zhǔn)備1化妝品原料1.1水溶性原料：可用魚胚胎培養(yǎng)液直接將受試物溶解配制成測試溶液。8.1.2非水溶性原料：可選常用溶劑如甲醇、二甲基亞硯、乙醇等助溶。如將受試物和有機(jī)溶劑按1：1（重量g：體積mL）混勻，超聲處理lOmin,然后加入魚胚胎培養(yǎng)液配制成所需濃度，震蕩30s后于6500xg離心lOmin。取上清液進(jìn)行測試。8.2化妝品產(chǎn)品8.2.1水溶性產(chǎn)品：可用魚胚胎培養(yǎng)液直接將受試物溶解配制成測試溶液。建議最高測試濃度為5g/L。8.2.2非水溶性產(chǎn)品：可選常用溶劑如甲醇、二甲基亞硯、乙醇等助溶。如將受試物和有機(jī)溶劑按1：1（重量g：體積mL）混勻，超聲處理1Omin,然后加入魚胚胎培養(yǎng)液配制成所需濃度，震蕩30s后于6500xg離心10min。取上清液進(jìn)行測試。8.3注意事項受試物測試溶液需測試前新鮮配制。測試濃度需保證對斑馬魚的死亡率＜10%（沒有心跳特征的胚胎界定為死亡）。測試時可根據(jù)需要設(shè)置多個濃度組。9測試步驟以下測試步驟是3cm培養(yǎng)皿測試指引。測試流程可參見附錄A圖A.挑選健康的受精后3天大的斑馬魚。9.1測試分組測試需設(shè)定模型對照組（硫酸銅工作液）、陽性對照組（硫酸銅工作液+吲味美辛工作液）和受試物組（硫酸銅工作液+受試物）。9.2模型對照組設(shè)置隨機(jī)挑選24尾魚胚胎于3cm培養(yǎng)皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅的魚胚胎培養(yǎng)液。9.3陽性對照組設(shè)置隨機(jī)挑選24尾魚胚于3cm培養(yǎng)皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和0.0036mg/LH引噪美辛的魚胚胎培養(yǎng)液。9.4受試物處理隨機(jī)挑選24尾魚胚于3cm培養(yǎng)皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和受試物的魚胚胎培養(yǎng)液。放置于28±1°C恒溫箱中培養(yǎng)40?4象寸n。應(yīng)用中性粒細(xì)胞熒光標(biāo)記斑馬魚9.5樣本的顯微分析將魚胚胎使用三部溶液麻醉，側(cè)身擺放。然后放到熒光顯微鏡下對魚胚胎尾部鏡下按統(tǒng)一的拍照參數(shù)進(jìn)行拍照。9.6數(shù)據(jù)分析計數(shù)每尾魚胚胎從肛門起四分之三尾部側(cè)線區(qū)域（見附錄B圖B）的中性粒細(xì)胞數(shù)目。10結(jié)果計算計算中性粒細(xì)胞聚集抑制率：■C—T抑制率=x100% （1）（1）式中：T一受試物處理組魚胚胎中性粒細(xì)胞數(shù)目的平均值；C一模型對照組魚胚胎中性粒細(xì)胞數(shù)目的平均值。對受試物處理組中性粒細(xì)胞數(shù)目和空白對照組中性粒細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行雙尾T檢驗，取得，值。11測試有效性驗證11.1測試判定各測試組暴露完成后至少90%魚胚胎存活，否則對應(yīng)測試組結(jié)果無效。

11.2測試要求每批次測試須設(shè)置陽性對照組，陽性對照組魚胚胎中性粒細(xì)胞聚集抑制率為正數(shù)且人〈0.05。12結(jié)果報告12.1ROS清除率受試物在對應(yīng)測試濃度下對中性粒細(xì)胞的聚集抑制率。12.2評價評價受試物抑制中性粒細(xì)胞聚集的能力，分析受試物處理組與模型對照組的檢測值是否具有統(tǒng)計學(xué)差異（p〈0.05）。1313結(jié)果相關(guān)性解讀在中性粒細(xì)胞聚集抑制率為正數(shù)且具有統(tǒng)計學(xué)差異（芯0.05）情況下，測試結(jié)果可作為受試物具有舒緩功效的支持證據(jù)，支持舒緩功效宣稱。附錄A（資料性附錄）圖A.測試流程圖3天大斑馬魚卵照片分析、中性28±1C暴露40-45min魚胚胎固定蘇丹黑染色、漂白顯微鏡拍照、粒細(xì)胞抑制率計算顯微鏡拍照、照片分析、中性粒細(xì)胞抑制率計算圖A.化妝品舒緩功效斑馬魚胚胎中性粒細(xì)胞聚集抑制測試流程圖附錄B（資料性附錄）圖B.測試結(jié)束時斑馬魚胚胎拍照圖示*紅色熒光點即為中性粒細(xì)胞（A法）。*深色點即為染色的中性粒細(xì)胞（B法）。

圖B:斑馬魚胚胎尾部中性粒細(xì)胞計數(shù)區(qū)域。參考文獻(xiàn)OECD.TestNo.236:FishEmbryoAcuteToxicity(FET)Test[S],OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,2003.T/SHRH036-2021化妝品黑色素抑制-斑馬魚胚胎測試方法[S]。T/GDST1-2021斑馬魚胚胎急性毒性測試A法和B法[S]。deOliveiraS,Reyes-AldasoroCC,CandelS,RenshawSA,MuleroV,&CaladoA.Cxcl8(IL-8)mediatesneutrophilrecruitmentandbehaviorinthezebrafishinflammatoryresponse[J].JImmunol.2013,190(8):4349-4359.HasegawaT,HallCJ,CrosierPS,AbeG,KawakamiK,KudoA,&KawakamiA.TraisientinHmmatoyresponsemediatedbyinterleukin-16isrequiredforproperregenerationinzebrafishfinfcld[J].Elife.2017?6:e22716.Heny Lo四esCA,貝eMK,&RenshawSA.Zebrafishasamodelforthestudyofneutiophilbiol