SDSPAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳詳解演示文稿

SDSPAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點一、什么是SDS？十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS)是一種陰離子去污劑。它在水溶液中以單體（monomer）和分子團（micellae）的混合形式存在。目前二頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點SDS的作用

破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變原有的構象，保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結合而形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復合物。目前三頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點二、SDS的基本原理（一）蛋白質(zhì)分子的解聚

樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。目前四頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點1、SDS

陰離子去污劑

變性劑

助溶性試劑

斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵

分子去折疊

破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結構

目前五頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點2、強還原劑

巰基乙醇（β-mercaptoethanal）

二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）

使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。目前六頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前七頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點SDS和還原劑的作用：

（1）分子被解聚或組成它們的多肽鍵

（2）氨基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負

電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。

（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超

過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除

了不同分子之間原有的電荷差異。目前八頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點

（1）形狀像一個長橢圓棒

（2）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的。

（3）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比。目前九頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點膠束在SDS系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。

當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD—200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關系目前十頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點3、影響SDS電泳的關鍵因素

（1）溶液中SDS單體濃度（>1mmol/L)

大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結合的重量比為1：1.4

（2）樣品緩沖液的離子強度（不>0.26)

低離子強度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。

目前十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（3）二硫鍵是否完全被還原

當二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關系。目前十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（二）緩沖系統(tǒng)的選擇

一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關鍵的。

目前十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點電泳緩沖液的種類：

1、磷酸緩沖液

2、Tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng)

3、咪唑緩沖液系統(tǒng)：

比磷酸緩沖系統(tǒng)的導電性低，電泳速

度要比后者快一倍。

4、尿素系統(tǒng)：

適用分子量低于15KD的蛋白樣品。

5、Tris-甘氨酸系統(tǒng)：

使用最多的緩沖液

6、Tris-硼酸鹽緩沖液：

測定糖蛋白的分子量

目前十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（三）凝膠濃度的選擇

由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇會直接影響分辨率。

不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應選用不同的凝膠濃度.

目前十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（四）分子量測定

1、相對遷移率（Rf）

Rf即用每個帶的遷移距離除以溴酚藍前沿的遷移距離得到的。

測量位置應在蛋白帶的中央。

蛋白帶遷移距離

Rf=————————

溴酚藍遷移距離

目前二十頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點蛋白帶遷移距離固定前的凝膠長度

Rf=—————————X—————————

干燥后的凝膠長度溴酚藍遷移距離

目前二十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點2、作圖

以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對數(shù)值為縱坐標，Rf為橫坐標繪圖目前二十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前二十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點3、通過測定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標

準曲線上讀出他的分子量

目前二十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點三、去污劑的選擇

無離子去污劑：LubroW；Brij35，Tween

Triton

陽離子去污劑：cetyltrimethylammonium

bromide（CTAB）

cetylpyyridinium（CPC）

陰離子去污劑：SDSdeoxycholate

目前二十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點四、方法

1、分類

（1）根據(jù)對樣品的處理方式的不同

還原SDS電泳

非還原SDS電泳

帶有烷基化作用的還原SDS電泳

目前二十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（2）根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同

連續(xù)電泳

不連續(xù)電泳

（3）根據(jù)電泳的形式

圓盤電泳

垂直電泳

平板電泳

水平電泳

目前二十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前二十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前二十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前三十頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點2、操作

（1）制備分離膠

（2）制備積層膠(堆積膠）目前三十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前三十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前三十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前三十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前三十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前三十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點分離膠聚合之后目前三十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前三十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前三十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前四十頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前四十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前四十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前四十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（3）加樣品

樣品的處理

在蛋白溶液中加入過量的SDS后，可引起以下的反應：

蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽

氫鍵斷裂

疏水相互作用被取消

多肽被去折疊(二級結構破壞),并形成橢球形目前四十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點①還原SDS處理

當加入還原試劑DTT或β-二巰基乙醇后，蛋白質(zhì)被完全去折疊，只根據(jù)分子量分離。目前四十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點②帶有烷基化作用的還原SDS處理

烷基化作用可以很好地并經(jīng)久牢固地保護SH基團，而得到窄的電泳帶。

目前四十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點③非還原的SDS處理

許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分鐘，并不需要加還原劑，此時二硫鍵不能被斷裂，蛋白并沒有完全被去折疊。

目前四十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（4）電泳（5）固定

目前四十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（6）染色

考馬斯亮藍（coomassiebrilliantblue）

①R-250

三苯基甲烷，紅藍色，每個分子含有兩個SO3H基團，偏酸性，和氨基黑一樣也是結合在蛋白質(zhì)的堿性基團上。

目前四十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前五十頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點②G-250

二甲花青亮藍，藍綠色。目前五十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前五十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點銀染色

銀染的機制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。

目前五十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前五十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（7）照相，凝膠干燥（8）定量測定

目前五十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點3、電泳過程中的不正?，F(xiàn)象

（1）“微笑”現(xiàn)象

指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。目前五十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（2）“皺眉”現(xiàn)象

由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。

目前五十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點目前五十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十六點（3）“拖尾”現(xiàn)象

樣品