液相色譜定量方法指導(dǎo)原則

關(guān)于液相色譜定量方法指導(dǎo)原則第1頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1有關(guān)色譜峰的基本概念（一）

峰底(CD):峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線峰高(h):峰最大值到峰底的距離峰寬(KL):在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離半高峰寬(W1/2):通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，其與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離峰面積（A）:峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值拖尾峰（Tailingpeak）:后沿較前沿平緩的不對(duì)稱峰前伸峰（Leadingpeak）:前沿較后沿平緩的不對(duì)稱峰基線（Baseline):在正常操作條件下，僅由流動(dòng)相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的曲線基線噪聲（N）:由各種因素所引起的基線波動(dòng)基線漂移(Baselinedrift):基線隨時(shí)間定向的緩慢變化第2頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1有關(guān)色譜峰的基本概念（二）第3頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2通過測(cè)量和計(jì)算得到的色譜參數(shù)（一）?死時(shí)間(deadtime，t0)—不保留組分的保留時(shí)間，即流動(dòng)相（溶劑）通過色譜柱的時(shí)間。?死體積(deadvolume，V0)—由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定

相所占據(jù)的空間。V0＝F×t0（F為流速）?保留時(shí)間(retentiontime，tR)—從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。?保留體積(retentionvolume，VR)—從進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積，又稱洗脫體積。VR＝F×tR。?調(diào)整保留時(shí)間(adjustedretentiontime，t'R)—扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)條件（溫度、固定相等）一定時(shí)，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0?調(diào)整保留體積(adjustedretentionvolume，V'R)—扣除死體積后的保留體積V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R第4頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2通過測(cè)量和計(jì)算得到的色譜參數(shù)(二）柱效能：色譜柱在分離過程中主要有動(dòng)力學(xué)參數(shù)決定的分離效能。通常用理論板數(shù)或有效板數(shù)表示。理論板數(shù)：

若應(yīng)用調(diào)整保留時(shí)間tR′計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(n有效或neff)有效板數(shù)：第5頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2通過測(cè)量和計(jì)算得到的色譜參數(shù)(三）

分離度：兩個(gè)相鄰色譜峰的分離程度，以兩個(gè)組分保留值之差與其平均峰寬之比表示。

第6頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分離度圖示第7頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月響應(yīng)值：組分通過檢測(cè)器系統(tǒng)產(chǎn)生的信號(hào)值。相對(duì)響應(yīng)值：?jiǎn)挝涣课镔|(zhì)與單位量參比物質(zhì)的響應(yīng)值之比。2通過測(cè)量和計(jì)算得到的色譜參數(shù)(四）第8頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月校正因子（f）：相對(duì)響應(yīng)值的倒數(shù)，它與峰面積的乘積正比于物質(zhì)的量。定量限（LOQ）：是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測(cè)能力。2通過測(cè)量和計(jì)算得到的色譜參數(shù)(五）

檢測(cè)限（LOD）：系指試樣中的被測(cè)物能被檢查的最低量，是鑒別試驗(yàn)的靈敏度指標(biāo)。其越低，反應(yīng)的靈敏度越高。第9頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3液相色譜的定性分析1、與已知物直接對(duì)照2、已知物峰高增加法3、二極管陣列檢測(cè)器的三維圖譜定性4、與其他儀器聯(lián)用定性第10頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4色譜法定量的依據(jù)

在一定的操作條件下，檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)（色譜峰的峰面積或峰高）與進(jìn)入檢測(cè)器組分的量成正比。即：mi=fiAi

或

mi=fihi式中：mi－組分的量

fi－比例常數(shù)這就是色譜法定量的依據(jù)。第11頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5峰面積

A的測(cè)量方法（一）（1）峰高

h乘半峰寬

w1/2

法將色譜峰視為等腰三角形，得到的面積為實(shí)際面積的0.94倍，故實(shí)際面積應(yīng)為：（適合于對(duì)稱峰）

A＝

1.065h×w1/2（相對(duì)計(jì)算可略去前面系數(shù)）（2）峰高乘平均峰寬法不對(duì)稱峰不能作前述近似，可于峰高0.15及0.85處測(cè)得峰寬，取其平均值進(jìn)行計(jì)算：

A=h×(w0.15+w0.85)/2第12頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5峰面積A的測(cè)量方法（二）（3）峰高乘保留時(shí)間法難以量度半峰寬的狹窄峰或半峰寬以上重疊的峰可用下式計(jì)算：A＝

1.065h×

b×tR

（相對(duì)計(jì)算可略去1.065和常數(shù)b）（4）剪紙稱重法對(duì)于不對(duì)稱或分離不完全的峰，可將峰剪下，以質(zhì)量代其面積，使用較少。第13頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（5）自動(dòng)積分法將記錄儀與自動(dòng)積分儀連接，可直接準(zhǔn)確、快速地測(cè)出峰的面積。（6）以峰高代替峰面積定量法當(dāng)各種實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格保持不變時(shí)，一定進(jìn)樣范圍內(nèi)色譜峰的半峰寬不變，即可用峰高代替峰面積定量，特別對(duì)于狹窄的峰，較面積定量法更為準(zhǔn)確。5峰面積A的測(cè)量方法（三）第14頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6

定量校正因子（一）檢測(cè)器對(duì)不同物質(zhì)的響應(yīng)值不同，故相同質(zhì)量的不同物質(zhì)通過檢測(cè)器時(shí)，產(chǎn)生的峰面積不等，因而不能直接應(yīng)用峰面積計(jì)算組分含量。為此引入“定量校正因子”以校正峰面積，使之能更真實(shí)地反映組分含量。前面已知：mi

＝

fiAi

即：fi

＝

mi/Ai第15頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6

定量校正因子（二）fi稱絕對(duì)校正因子，定量分析中常用的是相對(duì)校正因子f'i，定義為組分的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比：

mi、ms用質(zhì)量單位時(shí)，f'w稱相對(duì)質(zhì)量校正因子

mi、ms用摩爾為單位時(shí)，f'M稱相對(duì)摩爾校正因子注意：應(yīng)用中一般地略去“相對(duì)”兩字第16頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6

質(zhì)量校正因子的測(cè)定方法（三）準(zhǔn)確稱取一定量待測(cè)組分的純物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純物質(zhì)混和后，取一定量（在檢測(cè)器的線性范圍內(nèi)）在實(shí)驗(yàn)條件下注入色譜儀，出峰后分別測(cè)出兩者峰面積，由前式可求得校正因子。第17頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7

常用的幾種定量測(cè)定方法（一）（1）歸一法當(dāng)試樣中的全部組分都出峰（即都反映在色譜圖上）時(shí)，可以從校正后每峰峰面積占全部色譜峰總面積的分?jǐn)?shù)，求得該組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。xi%=×100

（可以為質(zhì)量百分含量或摩爾百分含量）第18頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7

常用的幾種定量測(cè)定方法（二）歸一法的特殊情況若試樣中各組分的相對(duì)校正因子很接近（如同系物中沸點(diǎn)接近的組分），上式則可簡(jiǎn)化為：xi%=×100

當(dāng)測(cè)量參數(shù)為峰高時(shí)，也可以用峰高歸一法計(jì)算組分含量。（用峰高校正因子，以峰高代峰面積代入前頁(yè)算式即可，）歸一法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)不足之處在于僅可使用于所有組分都出峰的情況第19頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7

常用的幾種定量測(cè)定方法（三）

（2）內(nèi)標(biāo)法使用條件：試樣中各組分不能全部出峰、各組分含量懸殊、僅需測(cè)定其中部分組分

操作步驟：

準(zhǔn)確稱取一定量的試樣；

加入一定量的選定標(biāo)準(zhǔn)物（內(nèi)標(biāo)物）；

混勻后進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析；

根據(jù)內(nèi)標(biāo)物和試樣質(zhì)量以及色譜圖上相應(yīng)的峰面積，計(jì)算待測(cè)組分的量。第20頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7

常用的幾種定量測(cè)定方法（四）內(nèi)標(biāo)法待測(cè)組分含量計(jì)算式如下（由前可推得）:（各符號(hào)意義同上）內(nèi)標(biāo)法中常以內(nèi)標(biāo)物為基準(zhǔn)，即：f's

＝1，也可用峰高代替峰面積，做法同上。第21頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法注意事項(xiàng)內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是試樣中不存在的純物質(zhì)；加入的內(nèi)標(biāo)物量與試樣中待測(cè)組分量相近；內(nèi)標(biāo)物的色譜峰應(yīng)位于待測(cè)組分色譜峰附近或幾個(gè)待測(cè)組分色譜峰之間。7

常用的幾種定量測(cè)定方法（五）第22頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：定量準(zhǔn)確，對(duì)試樣含有不出峰的組分情況下，也不影響測(cè)定。

缺點(diǎn)：每次測(cè)定都必須準(zhǔn)確稱取樣品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量，不適于快速分析。7

常用的幾種定量測(cè)定方法（六）第23頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)曲線法若以

Ci%對(duì)

Ai/As作圖，則可得一條通過原點(diǎn)的直線——內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。為一常數(shù)，上式則可化為：xi

%=用內(nèi)標(biāo)法待測(cè)組分含量計(jì)算式

若固定試樣稱取量，加入內(nèi)標(biāo)物也恒定，則有：7

常用的幾種定量測(cè)定方法（七）第24頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將待測(cè)組分的純物質(zhì)配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（系列）；b.取固定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)物，混合后進(jìn)樣分析，測(cè)出

Ai

和

As；c.用

Ai/As

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作圖，可得一組通過原點(diǎn)的直線（內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線）。7

常用的幾種定量測(cè)定方法（八）第25頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

樣品測(cè)定與組分定量稱取與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線相同量的試樣和內(nèi)標(biāo)物，測(cè)出其峰面積比，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查出待測(cè)組分的含量。內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用在生產(chǎn)過程控制分析上，不須計(jì)算校正因子，對(duì)液體樣品也可量取體積，具有簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)。7

常用的幾種定量測(cè)定方法（九）第26頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法a.取被測(cè)組分的純物質(zhì)，配制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液；b.分別取一定體積上述溶液注入色譜柱；c.得到色譜圖后測(cè)出峰面積或峰高；d.繪出峰面積（或峰高）對(duì)濃度的關(guān)系曲線——（標(biāo)準(zhǔn)曲線）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制7

常用的幾種定量測(cè)定方法（十）第27頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月外標(biāo)法樣品測(cè)定（一）在同樣操作條件下注入同樣量（一般為體積）的待測(cè)試樣，從色譜柱上測(cè)得峰面積或峰高，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查出待測(cè)組分的濃度。外標(biāo)法也用于生產(chǎn)過程的控制分析，操作簡(jiǎn)便，計(jì)算簡(jiǎn)單，但分析結(jié)果準(zhǔn)確性取決于操作條件的穩(wěn)定性和進(jìn)樣的重現(xiàn)性。7

常用的幾種定量測(cè)定方法（十一）第28頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月外標(biāo)法樣品測(cè)定（二）當(dāng)試樣中待測(cè)組分濃度變化不大時(shí)，可不必作標(biāo)準(zhǔn)曲線，而用單點(diǎn)校正法。即配制一個(gè)與被測(cè)組分含量接近的標(biāo)準(zhǔn)樣，分別取相同量體積進(jìn)樣，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣和待測(cè)樣的峰面積，按下式計(jì)算組分含量:Ci%=Ai/As×Cs%7

常用的幾種定量測(cè)定方法（十二）第29頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）標(biāo)準(zhǔn)加入法（一）標(biāo)準(zhǔn)加入法實(shí)質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，以欲測(cè)組分的純物質(zhì)加入到待測(cè)樣品中，分別測(cè)定加入前后的峰面積，從而計(jì)算欲測(cè)組分在樣品中的含量。a.可以單點(diǎn)加入，色譜條件完全相同的情況下，按以下公式計(jì)算：7

常用的幾種定量測(cè)定方法（十三）第30頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)加入法（二）b.可以加入一系列濃度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線外推法計(jì)算出欲測(cè)物在樣品中的含量。優(yōu)點(diǎn)：不需要另外的內(nèi)標(biāo)物，不必要進(jìn)樣非常準(zhǔn)確；操作簡(jiǎn)單；若在前處理過程加入，可補(bǔ)償被測(cè)組分在處理過程中的損失。缺點(diǎn)：色譜條件要求完全一致，否則會(huì)帶來分析誤差。7

常用的幾種定量測(cè)定方法（十四）第31頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

7

常用的幾種定量測(cè)定方法（十五）

標(biāo)準(zhǔn)加入法（三）標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制①

將一系列已知量待測(cè)物分別加入到幾等份的樣品中，配制成濃度為(cx+0),(cx+c1),(cx+c2),(cx+c3)……..和樣品有相同基體的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(加標(biāo)，spiking)；②

通過儀器分別測(cè)量以上系列溶液的響應(yīng)值S0，S1，S2，S3，S4……；③以響應(yīng)信號(hào)S對(duì)濃度c作圖，再將直線外推與濃度軸相交于一點(diǎn)(下圖)，求得樣品中待測(cè)物濃度cx。第32頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月cx0.00.20.0102030-10濃度，cSS2S3S4S10.40.60.81.01.2

當(dāng)樣品量很