30種氨基酸同時定量檢測方法及試劑盒制備

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103163226A,

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8,

-A-103163226,

103163226A,

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8,

8.3創(chuàng)造者麗宏,

鵬飛,

丹,

緒得,

蓓蓓申請人麗宏,

鵬飛,

丹導(dǎo)出引文BiBTe*,

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中國國家知識產(chǎn)權(quán)局,

歐洲專利數(shù)據(jù)庫(Espacenet)30種氨基酸同時定量檢測方法及試劑盒制備

103163226A摘要本創(chuàng)造提供一種高靈敏和高通量的30種氨基酸同時定量檢測試劑盒及其制備方法。復(fù)雜樣本中氨基酸經(jīng)有機溶劑提取處理后采用甲醇沉淀并參加穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸標(biāo)，用鹽酸正丁醇衍生化處理，吹干復(fù)溶后，采用C18鍵合相硅膠為固定相，以含七氟丁酸和甲酸的乙腈水為流動相進展反相色譜梯度別離，運用質(zhì)譜儀進展定量檢測。本創(chuàng)造的試劑盒，測試靈敏度可到達10ng/ml，各項方法學(xué)指標(biāo)均可滿足氨基酸臨床檢驗、工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究等定量需要。權(quán)利要求(8)1.一種高靈敏30種氨基酸同時定量檢測試劑盒，其特征在于由特定濃度的穩(wěn)定同位素標(biāo)樣本、質(zhì)控樣本、衍生化試劑、流動相調(diào)節(jié)液組成。2.根據(jù)權(quán)利I所述的30種氨基酸同時定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟:(1)穩(wěn)定同位素標(biāo)凍干粉的制備；(2)質(zhì)控樣本的配制；(3)衍生化試劑的制備；(4)流動相調(diào)節(jié)液的配制。3.—種30種氨基酸同時定量檢測方法，包括:(1)濃縮儲藏液和日常工作液的配制:取"穩(wěn)定同位素標(biāo)凍干粉〞用有機溶劑充分溶解，混勻，即為濃縮儲藏液，使用效期I個月；濃縮儲藏液用有機溶劑稀釋適宜倍數(shù)，即為日常工作液，使用效期I周。(2)樣本預(yù)處理:取一定量的樣本，參加日常工作液，渦流，高速離心取上清液，吹干或凍干或揮干，參加適量的衍生化試劑衍生化一定時間，吹干或凍干或揮干，參加復(fù)溶液復(fù)溶。(2)液相別離:a.采用C18、C8或氰基鍵和硅膠作固定相；b.流動相:甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸銨；甲酸銨；二乙胺?’三乙胺；等度或梯度洗脫；控制流速。(3)質(zhì)譜測定:電噴霧離子源；大氣壓化學(xué)電離源；正離子方式。4.根據(jù)權(quán)利3所述的30種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于同時定量檢測30種氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天門冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、氨酸、色氨酸、組氨酸、Y-氨基丁酸、絲胺酸、?；撬帷⒏彼?、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羥基賴氨酸、羥基脯氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、焦谷氨酸)中的一種或多種，包含且不限于此30種氨基酸。5.根據(jù)權(quán)利3所述的30種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于用乙腈、甲醇、三氯醋酸或高氯酸等蛋白沉淀劑進展蛋白沉淀。6.根據(jù)權(quán)利3所述的30種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于用鹽酸正丁醇進展衍生化處理。7.根據(jù)權(quán)利3所述的30種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于用穩(wěn)定同位素標(biāo)進展定量檢測。8.根據(jù)權(quán)利3所述的30種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于其所使用的流動相為:甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸銨；甲酸銨；二乙胺；三乙胺；反相色譜等度或梯度別離。說明30種氨基酸同時定量檢測方法及試劑盒制備所屬技術(shù)領(lǐng)域[0001]本創(chuàng)造涉及一種基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)開發(fā)的30種氨基酸同時定量檢測試劑盒，更具體地說是采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對樣本中30種氨基酸進展高靈敏度定量檢測的方法。[0002]本創(chuàng)造還涉及本創(chuàng)造試劑盒的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。背景技術(shù)[0003]氨基酸(Aminoacid)是含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱。自然界中已發(fā)現(xiàn)的氨基酸有180多種，人體重要的氨基酸有30多種。生命的產(chǎn)生、存在和消亡，無一不與蛋白質(zhì)有關(guān)，而氨基酸正是蛋白質(zhì)的根本單位，所以如果人體氨基酸發(fā)生變化，不在正常值圍，就會導(dǎo)致生理功能異常，影響機體代的正常進展，最后導(dǎo)致疾病。目前氨基酸代障礙所引起的疾病已超過400多種，涉及代、腫瘤、免疫、心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)、腎病、糖尿病、亞安康、老年病等各類疾病和人體生長發(fā)育、營養(yǎng)安康、肌肉骨骼生長、激素分泌、解毒功能等各個安康環(huán)節(jié)。[0004]氨基酸在醫(yī)藥上也有廣泛應(yīng)用。目前用作藥物的氨基酸有一百幾十種，其中包括構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有20種和構(gòu)成非蛋白質(zhì)的氨基酸有100多種。因此，檢測復(fù)雜樣本中氣基酸的含量對臨床檢驗、工業(yè)生廣和科學(xué)研究等都具有重要意義。[0005]1958年Spackman等首先提出了用陽離子交換色譜與柱后卻三酮衍生結(jié)合的方法分析蛋白質(zhì)中的氨基酸，實現(xiàn)了氨基酸分析的自動化。其后，新的氨基酸分析方法不斷涌現(xiàn)，柱前衍生反相高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法、毛細管電泳法、液相色譜法等相繼應(yīng)用于氨基酸分析。傳統(tǒng)的氨基酸分析技術(shù)已很難滿足極微量氨基酸的準(zhǔn)確和高通量檢測需求。[0006]液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)以液相色譜作為別離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)，樣本在液相色譜質(zhì)譜局部分別被別離及離子化，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖，具有高選擇性、高靈敏度、樣本處理簡單和自動化程度高的特點，日漸成為體外定性和定量分析的實用方法。研究開發(fā)一種結(jié)果準(zhǔn)確、嚴(yán)格區(qū)分同分異構(gòu)體、分析通量高、價格低廉、操作簡便、易于推廣的30種氨基酸LC-MS/MS同時定量檢測試劑盒，使其能廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣本中氨基酸臨床、科研和工業(yè)生產(chǎn)，將有助于提高氨基酸檢測質(zhì)量、促進檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)化。創(chuàng)造容[0007]本創(chuàng)造的目的在于提供一種高靈敏和高通量的30種氨基酸同時定量檢測試劑盒，以滿足臨床檢驗、工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究等對氨基酸定量檢則的需要。[0008]本創(chuàng)造的另一目的在于提供上述試劑盒的制備方法。[0009]技術(shù)方案[0010]本試劑盒是一種采用LC-MS/MS測定復(fù)雜樣本中30種氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天門冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、氨酸、色氨酸、組氨酸、Y-氨基丁酸、絲胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羥基賴氨酸、羥基脯氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、焦谷氨酸)濃度的新型試劑盒。復(fù)雜樣本中氨基酸經(jīng)有機溶劑提取處理后采用甲醇沉淀并參加穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸標(biāo)，用鹽酸正丁醇為衍生化試劑進展處理，吹干復(fù)溶后上清液進展LC-MS/MS檢測，記錄氨基酸和標(biāo)的峰面積。根據(jù)氨基酸對應(yīng)穩(wěn)定同位素標(biāo)濃度、樣本中的氨基酸/對應(yīng)同位素標(biāo)峰面積比值即可計算出每種氨基酸的濃度。測定結(jié)果為復(fù)雜樣本中氨基酸濃度。[0011]本創(chuàng)造的試劑盒制備過程包括如下步驟:[0012]1.穩(wěn)定同位素標(biāo)凍干粉:12種穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸對照品凍干粉(含2H4;5-13C-精氨酸、2H3-亮氨酸、2H3-甲硫氨酸、13C6-苯丙氨酸、2H3-天門冬氨酸、2H2-瓜氨酸、2H3-谷氨酸、2H8-纈氨酸、13C6-酪氨酸、2H4-丙氨酸、2H3-鳥氨酸均0.5pmoL;含15N；2-13C-甘氨酸2.5pmoL),貼簽標(biāo)記,完成操作。[0013]2.質(zhì)控樣本A的配制:精細稱取IOmg精氨酸對照品，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，配制成Img.mL—1的精氨酸儲藏液。精細量取精氨酸儲藏液871μL，置50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成17.42μg.πιΓ1的精氨酸(lOOymol/L)質(zhì)控樣本，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。[0014]3.質(zhì)控樣本B的配制:精細稱取IOmg苯丙氨酸對照品，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，配制成Img.mL—1的苯丙氨酸儲藏液。精細量取苯丙氨酸儲藏液413μL,置50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成8.26μg*mL_1的苯丙氨酸(50μmol/L)質(zhì)控樣本，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。[0015]4.衍生化試劑組分A:色譜純粹丁醇，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。[0016]5.衍生化試劑組分B:12mol/L鹽酸，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。[0017]6.流動相調(diào)節(jié)液A的配制:色譜純甲酸，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。[0018]7.流動相調(diào)節(jié)液B的配制:色譜純七氟丁酸，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。[0019]本創(chuàng)造的試劑盒使用方法如下:[0020]取10μL樣本置于1.5mLEP管中，參加日常工作液100μL，13200r/min離心2min。將離心后的上清液直接轉(zhuǎn)移到另一1.5mLEP管中，氮氣保護下50°C吹干，參加60μL衍生化試劑，密封，渦旋30s，瞬時離心，65°C孵育15min進展衍生化。衍生后的溶液再次瞬時離心，在氮氣保護下5011C吹干。參加100μL復(fù)溶液復(fù)溶,潤旋30s,13200r/min離心2min,進樣5μL進展LC-MS/MS分析。[0021]有益效果[0022]本創(chuàng)造試劑盒采用LC-MS/MS同時定量檢測復(fù)雜樣本中30種氨基酸的濃度，建立了一種高靈敏度(pmol級)和準(zhǔn)確性的30種氨基酸LC-MS/MS定量方法，同分異構(gòu)體根本都能基線別離，方法操作簡單、快速、高通量，可用于臨床檢驗、工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中樣本的檢測。同時，本創(chuàng)造試劑盒首次實現(xiàn)多種氨基酸LC-MS/MS定量檢測技術(shù)國產(chǎn)化，它的推廣應(yīng)用將有助于提氨基酸檢測質(zhì)量、促進檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)化。附圖說明[0023]圖1氨基酸樣本處理和檢測過程[0024]圖230種氨基酸總離子流圖[0025]圖3氨基酸同分異構(gòu)體基線別離圖具體實施方式[0026]1、適用儀器[0027]液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)，配備電噴霧離子源(ESI)。[0028]2、樣本要求[0029]血漿樣本:采集靜脈全血樣本，置于抗凝管中，采血后立即顛倒混勻5?6次，于30min以離心別離血漿，_20°C冰凍保存待測。[0030]尿樣、腦脊液:取樣后直接-20°C冰凍保存待測。[0031]組織樣本:生物組織或研磨或勻漿處理并用有機溶劑充分提取后，高速離心取上清液，用提取試劑稀釋到適宜的濃度，-20°C冰凍保存待測。[0032]其它需測定游離氨基酸的樣本:充分溶解或浸泡后，用甲醇水(I:lv/v)充分提取，高速離心取上清液，用提取試劑稀釋到適宜的濃度，-20°C冰凍保存待測。[0033]其它需測定全部氨基酸的樣本:稱取一定量樣本，參加適量的鹽酸^mol/L)，密封，110°C高溫水解24h，水解完自然冷卻后，取出水解液過0.45μm水系濾膜。所得濾液取一定量在50°C下氮氣吹干，用甲醇水(I:lv/v)復(fù)溶并稀釋到適宜的濃度，-20°C冰凍保存待測。[0034]3、檢驗前準(zhǔn)備[0035]濃縮儲藏液的配制:取"穩(wěn)定同位素標(biāo)凍干粉〞用2mL甲醇充分溶解，混勻，即為濃縮儲藏液，分裝，密封4°C保存待用，使用效期I個月。[0036]日常工作液的配制:取濃縮儲藏液，甲醇稀釋100倍，分裝，密封4°C保存待用，使用效期I周。[0037]衍生化試劑的配制(鹽酸正丁醇):衍生化試劑組分A-衍生化試劑組分B(95:5v/v)，混勻，密封4°C保存待用。[0038]復(fù)溶液的配制:乙腈-水(4:lv/v)，混勻，密封4°C保存待用。[0039]4、檢驗方法[0040]全血樣本前處理:[0041]取10μL樣本置于1.5mLEP管中，參加日常工作液100μL，13200r/min離心2min。將離心后的上清液直接轉(zhuǎn)移到另一1.5mLEP管中，氮氣保護下50°C吹干，參加60μL衍生化試劑，密封，渦旋30s，瞬時離心，65°C孵育15min進展衍生化。衍生后的溶液再次瞬時離心，在氮氣保護下5(TC吹干。參加100μL復(fù)溶液復(fù)溶,潤旋30s,13200r/min離心2min,進樣5μL進展LC-MS/MS分析。[0042]質(zhì)譜條件:[0043]離子源:電噴霧離子源(ESI)，正離子方式檢測；離子噴射電壓:5500V;溫度:5800C;源氣體I(GSl，N2)壓力:55ps1.;氣體2(GS2，N2)壓力:60ps1.;氣簾氣體(N2)壓力:20ps1.;掃描方式為多重反響監(jiān)測(MRM);碰撞氣(N2)壓力=Medium;解簇電壓(DP)為:35V;碰撞能量(CE)為:30eV;30種氨基酸用于定量分析的離子對見表I,同位素標(biāo)記的氨基酸標(biāo)及用于定量分析的離子對見表2。[0044]表130種氨基酸及用于定量分析的離子對[0045][0046]色譜條件:[0047]色譜柱:C18柱(150*4.6mm，5μm粒徑);[0048]流動相:含0.1%流動相調(diào)節(jié)液A和0.01%流動相調(diào)節(jié)液B的乙腈-含0.1%流動相調(diào)節(jié)液A和0.01%流動相調(diào)節(jié)液B的水溶液，梯度洗脫；[0049]柱溫:50°C;進樣量:5μL0[0050]測定法:[0051]取處理好的質(zhì)控樣本和待測樣本溶液各5μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖。[0052]質(zhì)控要求:[0053]每I分析批樣本隨行2個質(zhì)控樣本(質(zhì)控樣本A和質(zhì)控樣本B)。質(zhì)控樣本測定結(jié)果偏差應(yīng)小于20%。如質(zhì)控樣本測定結(jié)果不符合上述要求，則該分析批樣本測試結(jié)果作廢，重新檢測。[0054]表2氨基酸標(biāo)及用于定量分析的離子對[0055][0058]5、結(jié)果計算:[0059]回收率的計算:計算質(zhì)控樣本A和質(zhì)控樣本B對應(yīng)的精氨酸和苯丙氨酸的濃度。質(zhì)控樣本回收率的計算公式為:回收率(％)=測定濃度/標(biāo)示濃度*100，回收率(％)應(yīng)在100±20%圍。[0060]樣本結(jié)果計算:提取30種氨基酸對應(yīng)的樣本和標(biāo)的MRM離子流圖，進展積分處理。每5μL進樣中，含有12.5pmol從日常工作液中帶入的精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天門冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、纈氨酸、酪氨酸、丙氨