扎來普隆舌下噴霧劑在比格犬體內(nèi)的相對生物利用度

扎來普隆舌下噴霧劑在比格犬體內(nèi)的相對生物利用度【摘要】目的研究扎來普隆舌下噴霧劑在比格犬體內(nèi)相對生物利用度。方法采用隨機交叉試驗設計，6條健康比格犬分別給舌下噴霧劑和分散片兩種制劑各10mg，反相高效液相色譜法測定血漿中扎來普隆的濃度。結(jié)果比格犬在服用舌下噴霧劑和口腔分散片后扎來普隆的Cmax分別為μg/L和μg/L。tmax分別為min和min，t1/2分別為min和min，AUCo-6h分別為μg/和μg/。AUC0-∞分別為μg/和μg/。扎來普隆舌下噴霧劑相對于分散片的生物利用度為%。結(jié)論兩制劑的各藥動學參數(shù)間差異均無顯著性，經(jīng)雙單側(cè)t檢驗證實，兩制劑具有生物等效性。

【關鍵詞】扎來普?。簧嘞聡婌F劑；生物利用度；比格犬；反相高效液相色譜法

【Abstract】ObjectiveTostudytherelativebioavailabilityofzaleplonbysublingualsprayinhealthybeagledogs.MethodsInarandomizedcrossoverstudy,6healthybeagledogsweregivenadoseof10mgzaleplonbysublingualsprayordispersibletablets.ZaleplonconcentrationinplasmawasdeterminedbyaRP-HPLC.ResultsAfteradministrationofsublingualsprayanddispersibletablets,thepharmacokineticparametersasfollowed:Cmaxwereμg/Landμg/L,tmaxwereminandmin，t1/2wereminandmin,AUCo-6hwereμg/andμg/,AUC0-∞wereμg/andμg/respectively.Therelativebioavailabilityofsublingualspraywas%,comparingwiththatofdispersibletablets.ConclusionThereisnosignificantdifferenceinpharmacokineticparametersbetweenthetwopreparations.Itisdemonstratedthatthetwopreparationsarebioequivalentbytwoone-sidettests.

【Keywords】zaleplon;sublingualspray;bioavailability;Beagledog;reversedphrasehighperformanceliquidchromatography

扎來普隆為美國WyethAyerstLaboratoriesInc．研制的新型非苯二氮艸卓類催眠藥，具有鎮(zhèn)靜催眠、肌肉松弛、抗焦慮和抗驚厥作用［1］。美國FDA于1999年8月批準該藥上市，用于成年人失眠的短期治療［2］。扎來普隆可選擇性地結(jié)合I型苯二氮艸卓類受體亞族，與唑吡坦的作用機制相似，其特點是起效快，半衰期短，無宿醉現(xiàn)象，因而受到患者歡迎。本試驗以扎來普隆分散片為參比制劑，研究了扎來普隆舌下噴霧劑的比格犬體內(nèi)相對生物利用度［3］，為臨床合理用藥提供科學依據(jù)。

1儀器與試藥

LC-10AT高效液相色譜儀，包括LC-10AT泵，SPD-10A檢測器，N2000雙通道色譜工作站；渦旋振蕩器：QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；離心機：AnkeTDL-40Bcentrifuge；參比制劑：扎來普隆分散片；受試制劑：扎來普隆舌下噴霧劑；內(nèi)標：艾司唑侖，湖北制藥廠，批號20011003M）；乙腈-甲醇為色譜純。比格犬，雌雄各半，體重8～10kg，由北京科宇提供。

2方法

色譜條件流動相：乙腈-甲醇-水；流速：ml/min；檢測波長：230nm；色譜柱：AgilentEclipsexDBC8；柱溫：30℃。

血漿樣品萃取劑的選擇與優(yōu)化分別制備含扎來普隆100ng/ml的血漿樣品，取ml于尖嘴玻璃試管中，分別加入3ml乙醚、乙酸乙酯，體積比1:1和1:2比例的乙醚和正己烷的混合液蝸旋3min，3000rpm離心10min，取上清液，N2吹干，50μl流動相復溶，進樣，20μl定量環(huán)定量。比較經(jīng)兩種方法處理后的含藥血漿的色譜圖，以確定萃取劑。

方法專屬性分別取比格犬空白血漿，空白血漿外加扎來普隆標準品和內(nèi)標，以及扎來普隆舌下給藥后30min的血漿樣品加內(nèi)標各50μl按上述方法操作，記錄HPLC色譜圖，考察扎來普隆與狗血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)的分離情況。

標準曲線和線性范圍取比格犬空白血漿，分別加含內(nèi)標的扎來普隆系列標準溶液50μl，配制成相當于濃度分別為10、20、50、100、200ng/ml的血漿樣品，按血漿樣品處理項下依法操作，建立標準曲線。以血漿樣品中扎來普隆與內(nèi)標色譜峰面積的比值為橫坐標，以血漿樣品中扎來普隆濃度為縱坐標，進行回歸運算，求得直線的回歸方程并繪制標準曲線。

精密度取比格犬空白血漿，分別加含內(nèi)標的扎來普隆系列標準溶液50μl，配制低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品各5份，進樣測定，連續(xù)測定3天，以扎來普隆峰面積與內(nèi)標峰面積比值計算日內(nèi)和日間標準差。

準確度取比格犬空白血漿ml，分別加含內(nèi)標200ng/ml的扎來普隆系列標準溶液50μl，配制低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品，每一濃度進行5樣本分析，將所得色譜峰面積分別與扎來普隆低、中、高3個濃度的標準溶液的色譜峰面積比較，考察樣品的絕對回收率；另將所得色譜峰面積比分別代入血漿標準曲線，計算測得藥物濃度，與加入量比較，考察樣品的相對回收率。

最低定量限根據(jù)標準曲線制備時扎來普隆為10ng/ml的5份樣品的峰面積，計算其RSD值，確定最低定量限。

比格犬體內(nèi)藥動學試驗6只比格犬隨機分為兩組，禁食12h于清晨空腹口服扎來普隆分散片2片或扎來普隆舌下噴霧劑4噴，采血期間不得離開，避免劇烈運動。清洗1周后，交叉給藥。并于服藥前和服藥后10、20、30、45、60、75、90、120、150、180、240、360、480min分別從股靜脈取血5ml，放置后3000rpm離心10min，取上層血清放置于-4℃冰箱中冷凍保存，以供測定用。

3結(jié)果

血漿樣品處理比較經(jīng)乙醚、乙酸乙酯、乙醚：正己烷、乙醚：正己烷四種萃取劑處理后的比格犬空白血漿的HPLC色譜圖見。結(jié)果表明乙醚：正己烷萃取后樣品峰分離良好，沒有干擾，而其余萃取劑萃取后，扎來普隆與內(nèi)源性雜質(zhì)分離較差。因此，最后選擇乙醚:正己烷作為含藥血漿扎來普隆的萃取劑。

最終確定血漿樣品處理過程取血漿至于10ml的尖嘴玻璃離心管中，加入內(nèi)標50μl，蝸旋混勻，加乙醚：正己烷，蝸旋3min，3000rpm離心10min。取上層有機相ml，置于已加了30μl飽和羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液的玻璃試管中，45℃水浴，N2吹至只剩下水層。45℃真空干燥，50μl流動相復溶，蝸旋使充分溶解，進樣，20μl定量環(huán)定量。

方法專屬性比格犬空白血漿、空白血漿外加扎來普隆標準品及比格犬給藥后血漿樣品的色譜圖見。AAceticetherasextractionsolution;BEtherasextractionsolution;CEther:n-hexaneasextractionsolution;DEther:n-hexaneasextractionsolution

HPLCchromatogramsofzaleplonandinternalstandardinblankplasma1zaleplon,2internalstandard；ABlankplasma;Bzaleplonandinternalstandardinblankplasma;CDogplasma30minafteradministrateofzaleplonatdosesof10mgandspikedwithISsolution

Chromatogramsofzaleploninplasma結(jié)果表明，比格犬血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對扎來普隆測定不產(chǎn)生干擾，該方法專屬性良好。

標準曲線和線性范圍扎來普隆與內(nèi)標峰面積比R對扎來普隆血漿藥物濃度的直線回歸方程為Y=r2=，本法在10～200ng/ml線性范圍良好，標準曲線見。Calibration精密度扎來普隆比格犬血漿樣品的日內(nèi)日間精密度結(jié)果如由上結(jié)果可見，該方法的精密度符合生物樣品測定的精密度要求。

準確度扎來普隆比格犬血漿樣品的回收率試驗結(jié)果見。Recoveryofzaleplonindogplasma

最低定量限標準曲線制備時扎來普隆為10的5份樣品的色譜峰面積比分別為、、、、，RSD值為%，符合生物樣品測定的精密度要求，所以該方法的最低定量限為10ng，色譜圖見。

數(shù)據(jù)處理藥動學參數(shù)tmax、Cmax取實測值；以消除相LnC-t直線回歸斜率k計算t1/2，t1/2=/k；以梯形法計算AUC0-t，AUCt-∞=C/k，AUC0-∞=AUC0-t+AUCt-∞。相對生物利用度由受試制劑和參比制劑的AUC0-t比較而得；生物等效性評價:tmax以Wilcoxon方法檢驗，Cmax、AUC0-t、AUCt-∞先進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，再做方差分析和雙單側(cè)t檢驗，在α=時差異無顯著性，受試制劑和參比制劑生物等效，扎來普隆的主要藥動學參數(shù)見表，曲線見。1zaleplon;2internalstandard

4討論與結(jié)論

血漿中扎來普隆的測定方法，國內(nèi)外均有高效液相熒光檢測法、HPLC-MS的報道，本文采用高效液相色譜法，用內(nèi)標法定量，最低定量限可達10ng/ml。采用230nm為檢測波長，血漿內(nèi)源性干擾較少，方法專屬性較好。實驗過程中，在吹干時，藥物容易貼在試管壁上，直接用流動相復溶后，所測的數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，重復性差，考慮過用正己烷反萃、超聲復溶，效果均不太理想，由于羥丙基-β-環(huán)糊精在片劑中用作崩解劑，故在復溶前加入HP-β-CD，解決了藥物貼壁難于復溶的問題，使藥物能夠完全溶于流動相，提高方法的重復性。實驗數(shù)據(jù)表明，該法靈敏度高，操作簡單、準確，能夠用于扎來普隆的比格犬血漿藥物濃度檢測，適用于扎來普隆體內(nèi)藥物動力學研究。

兩制劑的Cmax和AUC經(jīng)方差分析和雙單側(cè)t檢驗表明扎來普隆舌下噴霧劑與分散片具有生物等效性。扎來普隆舌下