2015版無菌檢查法

2015版無菌檢查法姜珊2014.10.072015版無菌檢查法無菌檢查法無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定,僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染2015版無菌檢查法環(huán)境潔凈度2010版無菌檢查應在環(huán)境潔凈度

10000級下的局部潔凈度

100級的單向流空氣區(qū)域內或隔離系統(tǒng)中進行2015版無菌檢查應在無菌條件下進行，試驗環(huán)境必須達到無菌檢查的要求，檢驗全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。2015版無菌檢查法培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌培養(yǎng)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。制備好的培養(yǎng)基應保存在2～25℃、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在3周內使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內使用。2015版無菌檢查法培養(yǎng)基PH區(qū)別2010版2015版改良馬丁培養(yǎng)基調節(jié)

pH

值使滅菌后為

6.4

±

0.2

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基調節(jié)pH使滅菌后pH值為7.3±0.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基調節(jié)

pH

值使滅菌后為

7.2

±

0.2

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基調節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基調節(jié)pH

值使滅菌后為

7.2±0.2沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基調節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基調節(jié)

pH值使滅菌后為

6.4±0.2沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基調節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.22015版無菌檢查法培養(yǎng)基的適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應無菌生長。2015版無菌檢查法培養(yǎng)基的適用性檢查靈敏度檢查菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)24～48小時，上述培養(yǎng)物用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。2015版無菌檢查法培養(yǎng)基適用性檢查直觀區(qū)別2010版2015版相應菌種接種所用培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度23～28℃20～25℃稀釋液0.9%無菌氯化鈉溶液pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液2015版無菌檢查法培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7

支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支,分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結果。2015版無菌檢查法培養(yǎng)基接種直觀區(qū)別2010版2015版硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌改良馬丁培養(yǎng)基5支白色念珠菌、黑曲霉胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉2015版無菌檢查法方法適用性試驗菌種及菌液制備除大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102〕外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。2015版無菌檢查法方法適用性試驗薄膜過濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5

天，各試驗菌同法操作。2015版無菌檢查法方法適用性試驗結果判斷與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。2015版無菌檢查法供試品的無菌檢查無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性質允許，應采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與方法適用性試驗確認的方法相同。無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明有效性，且對微生物無毒性。2015版無菌檢查法供試品的無菌檢查檢驗數(shù)量檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量檢驗量是指供試品每個最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量（g或ml）。2015版無菌檢查法供試品的無菌檢查陽性對照應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法適用性試驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查時每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48～72小時應生長良好。陰性對照供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。2015版無菌檢查法供試品的無菌檢查薄膜過濾法薄膜過濾法應采用封閉式薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45μm。直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前應先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，且總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。2015版無菌檢查法供試品的無菌檢查水溶液供試品取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含不少于100ml適宜稀釋液的無菌容器中，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不少于三次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗。除生物制品外，一般樣品沖洗后，1份濾器加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。2015版無菌檢查法供試品的無菌檢查培養(yǎng)及觀察將上述接種供試品后的培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天；一份置30～35℃培養(yǎng)，一份置20～25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。2015版無菌檢查法培養(yǎng)及觀察直觀區(qū)別2010版2015版培養(yǎng)

14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)

2天、真菌培養(yǎng)

3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁2015版無菌檢查法供試品的無菌檢查結果判斷陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時方可判試驗結果無效：（1）無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌