GATK使用方法詳解plob最詳盡說明書

年4月19日GATK使用方法詳解plob最詳盡說明書文檔僅供參考GATK使用方法詳解一、使用GATK前須知事項：（1）對GATK的測試主要使用的是人類全基因組和外顯子組的測序數(shù)據(jù)，而且全部是基于illumina數(shù)據(jù)格式，當(dāng)前還沒有提供其它格式文件（如IonTorrent）或者實驗設(shè)計（RNA-Seq）的分析方法。（2）GATK是一個應(yīng)用于前沿科學(xué)研究的軟件，不斷在更新和修正，因此，在使用GATK進行變異檢測時，最好是下載最新的版本，當(dāng)前的版本是2.8.1（-02-25）。下載網(wǎng)站：。（3）在GATK使用過程中（見下面圖），有些步驟需要用到已知變異信息，對于這些已知變異，GATK只提供了人類的已知變異信息，能夠在GATK的FTP站點下載（GATKresourcebundle）。如果要研究的不是人類基因組，需要自行構(gòu)建已知變異，GATK提供了詳細(xì)的構(gòu)建方法。（4）GATK在進行BQSR和VQSR的過程中會使用到R軟件繪制一些圖，因此，在運行GATK之前最好先檢查一下是否正確安裝了R和所需要的包，所需要的包大概包括ggplot2、gplots、bitops、caTools、colorspace、gdata、gsalib、reshape、RColorBrewer等。如果畫圖時出現(xiàn)錯誤，會提示需要安裝的包的名稱。二、GATK的使用流程GATK最佳使用方案：共3大步驟，即:\o"GATK使用方法詳解（原始數(shù)據(jù)的處理）"原始數(shù)據(jù)的處理-->\o"GATK使用方法詳解（變異檢測）"變異檢測

-->\o"GATK使用方法詳解（初步分析）"初步分析。原始數(shù)據(jù)的處理1.對原始下機fastq文件進行過濾和比對（mapping）對于Illumina下機數(shù)據(jù)推薦使用bwa進行mapping。Bwa比對步驟大致如下：（1）對參考基因組構(gòu)建索引：例子：bwaindex-abwtswhg19.fa。構(gòu)建索引時需要注意的問題：bwa構(gòu)建索引有兩種算法，兩種算法都是基于BWT的，這兩種算法經(jīng)過參數(shù)-ais和-abwtsw進行選擇。其中-abwtsw對于短的參考序列是不工作的，必須要大于等于10Mb；-ais是默認(rèn)參數(shù)，這個參數(shù)不適用于大的參考序列，必須要小于等于2G。（2）尋找輸入reads文件的SA坐標(biāo)。對于pairend數(shù)據(jù)，每個reads文件單獨做運算，singleend數(shù)據(jù)就不用說了，只有一個文件。pairend：bwaalnhg19.faread1.fq.gz-t4-I>read1.fq.gz.saibwaalnhg19.faread2.fq.gz-t4-I>read2.fq.gz.saisingleend：bwaalnhg19.faread.fq.gz-l30-k2-t4-I>read.fq.gz.sai主要參數(shù)說明：-oint：允許出現(xiàn)的最大gap數(shù)。-eint：每個gap允許的最大長度。-dint：不允許在3’端出現(xiàn)大于多少bp的deletion。-iint：不允許在reads兩端出現(xiàn)大于多少bp的indel。-lint：Read前多少個堿基作為seed，如果設(shè)置的seed大于read長度，將無法繼續(xù)，最好設(shè)置在25-35，與-k2配合使用。-kint：在seed中的最大編輯距離，使用默認(rèn)2，與-l配合使用。-tint：要使用的線程數(shù)。-Rint：此參數(shù)只應(yīng)用于pairend中，當(dāng)沒有出現(xiàn)大于此值的最佳比對結(jié)果時，將會降低標(biāo)準(zhǔn)再次進行比對。增加這個值能夠提高配對比正確準(zhǔn)確率，可是同時會消耗更長的時間，默認(rèn)是32。-Iint：表示輸入的文件格式為Illumina1.3+數(shù)據(jù)格式。-Bint：設(shè)置標(biāo)記序列。從5’端開始多少個堿基作為標(biāo)記序列，當(dāng)-B為正值時，在比對之前會將每個read的標(biāo)記序列剪切，并將此標(biāo)記序列表示在BCSAM標(biāo)簽里，對于pairend數(shù)據(jù)，兩端的標(biāo)記序列會被連接。-b：指定輸入格式為bam格式。這是一個很奇怪的功能，就是對其它軟件的bam文件進行重新比正確意思bwaalnhg19.faread.bam>read.fq.gz.sai（3）生成sam格式的比對文件。如果一條read比對到多個位置，會隨機選擇一種。例子：singleend：bwasamsehg19.faread.fq.gz.sairead.fq.gz>read.fq.gz.sam參數(shù)：-nint：如果reads比對次數(shù)超過多少次，就不在XA標(biāo)簽顯示。-rstr：定義頭文件?！瓳RG\tID:foo\tSM:bar’，如果在此步驟不進行頭文件定義，在后續(xù)\o"ViewallpostsinGATK"GATK分析中還是需要重新增加頭文件。pairend：bwasampe-a500read1.fq.gz.sairead2.fq.gz.sairead1.fq.gzread2.fq.gz>read.sam參數(shù)：-aint：最大插入片段大小。-oint：pairend兩reads中其中之一所允許配正確最大次數(shù)，超過該次數(shù)，將被視為singleend。降低這個參數(shù)，能夠加快運算速度，對于少于30bp的read，建議降低-o值。-rstr：定義頭文件。同singleend。-nint：每對reads輸出到結(jié)果中的最多比對數(shù)。對于最后得到的sam文件，將比對上的結(jié)果提取出來（awk即可處理），即可直接用于\o"ViewallpostsinGATK"GATK的分析。注意：由于\o"ViewallpostsinGATK"GATK在下游的snp-calling時，是按染色體進行call-snp的。因此，在準(zhǔn)備原始sam文件時，能夠先按染色體將文件分開，這樣會提高運行速度。可是當(dāng)數(shù)據(jù)量不足時，可能會影響后續(xù)的VQSR分析，這是需要注意的。2.對sam文件進行進行重新排序（reorder）由BWA生成的sam文件時按字典式排序法進行的排序（lexicographically）進行排序的（chr10，chr11…chr19，chr1，chr20…chr22，chr2，chr3…chrM，chrX，chrY），可是\o"ViewallpostsinGATK"GATK在進行callsnp的時候是按照染色體組型（karyotypic）進行的（chrM，chr1，chr2…chr22，chrX，chrY），因此要對原始sam文件進行reorder。能夠使用picard-tools中的ReorderSam完成。eg.java-jarpicard-tools-1.96/ReorderSam.jarI=hg19.samO=hg19.reorder_00.samREFERENCE=hg19.fa注意：1)這一步的頭文件能夠人工加上，同時要確保頭文件中有的序號在下面序列中也有對應(yīng)的。雖然在\o"ViewallpostsinGATK"GATK網(wǎng)站上的說明chrM能夠在最前也能夠在最后，可是當(dāng)把chrM放在最后時可能會出錯。2)在進行排序之前，要先構(gòu)建參考序列的索引。e.g.samtoolsfaidxhg19.fa。最后生成的索引文件：hg19.fa.fai。3)如果在上一步想把大文件切分成小文件的時候，頭文件能夠自己手工加上，之后運行這一步就好了。

3.將sam文件轉(zhuǎn)換成bam文件（bam是二進制文件，運算速度快）這一步可使用samtoolsview完成。e.g.samtoolsview-bShg19.reorder_00.sam-ohg19.sam_01.bam

4.對bam文件進行sort排序處理這一步是將sam文件中同一染色體對應(yīng)的條目按照坐標(biāo)順序從小到大進行排序。能夠使用picard-tools中SortSam完成。e.g.java-jarpicard-tools-1.96/SortSam.jarINPUT=hg19.sam_01.bamOUTPUT=hg19.sam.sort_02.bamSORT_ORDER=coordinate

5.對bam文件進行加頭（head）處理\o"ViewallpostsinGATK"GATK2.0以上版本將不再支持無頭文件的變異檢測。加頭這一步能夠在BWA比正確時候進行，經(jīng)過-r參數(shù)的選擇能夠完成。如果在BWA比對期間沒有選擇-r參數(shù)，能夠增加這一步驟?？墒褂胮icard-tools中AddOrReplaceReadGroups完成。e.g.java-jarpicard-tools-1.96/AddOrReplaceReadGroups.jarI=hg19.sam.sort_02.bamO=hg19.reorder.sort.addhead_03.bamID=hg19IDLB=hg19IDPL=illuminePU=hg19PUSM=hg19IDstr：輸入reads集ID號；LB：read集文庫名；PL：測序平臺（illunima或solid）；PU：測序平臺下級單位名稱（run的名稱）；SM：樣本名稱。注意：這一步盡量不要手動加頭，本人嘗試過多次手工加頭，雖然看起來與軟件加的頭是一樣的，可是程序卻無法運行。

6.Merge如果一個樣本分為多個lane進行測序，那么在進行下一步之前能夠?qū)⒚總€lane的bam文件合并。e.g.java-jarpicard-tools-1.70/MergeSamFiles.jarINPUT=lane1.bamINPUT=lane2.bamINPUT=lane3.bamINPUT=lane4.bam……INPUT=lane8.bamOUTPUT=sample.bam

7.DuplicatesMarking在制備文庫的過程中，由于PCR擴增過程中會存在一些偏差，也就是說有的序列會被過量擴增。這樣，在比正確時候，這些過量擴增出來的完全相同的序列就會比對到基因組的相同位置。而這些過量擴增的reads并不是基因組自身固有序列，不能作為變異檢測的證據(jù)，因此，要盡量去除這些由PCR擴增所形成的duplicates，這一步能夠使用picard-tools來完成。去重復(fù)的過程是給這些序列設(shè)置一個flag以標(biāo)志它們，方便\o"ViewallpostsinGATK"GATK的識別。還能夠設(shè)置REMOVE_DUPLICATES=true來丟棄duplicated序列。對于是否選擇標(biāo)記或者刪除，對結(jié)果應(yīng)該沒有什么影響，\o"ViewallpostsinGATK"GATK官方流程里面給出的例子是僅做標(biāo)記不刪除。這里定義的重復(fù)序列是這樣的：如果兩條reads具有相同的長度而且比對到了基因組的同一位置，那么就認(rèn)為這樣的reads是由PCR擴增而來，就會被\o"ViewallpostsinGATK"GATK標(biāo)記。e.g.java-jarpicard-tools-1.96/MarkDuplicates.jarREMOVE_DUPLICATES=falseMAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000INPUT=hg19.reorder.sort.addhead_03.bamOUTPUT=hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bamMETRICS_FILE=hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.metrics注意：dedup這一步只要在library層面上進行就能夠了，例如一個sample如果建了多個庫的話，對每個庫進行dedup即可，不需要把所有庫合成一個sample再進行dedup操作。其實并不能準(zhǔn)確的定義被mask的reads到底是不是duplicates，重復(fù)序列的程度與測序深度和文庫類型都有關(guān)系。最主要目的就是盡量減小文庫構(gòu)建時引入文庫的PCRbias。

8.要對上一步得到的結(jié)果生成索引文件能夠用samtools完成，生成的索引后綴是bai。e.g.samtoolsindexhg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam9.Localrealignmentaroundindels這一步的目的就是將比對到indel附近的reads進行局部重新比對，將比正確錯誤率降到最低。一般來說，絕大部分需要進行重新比正確基因組區(qū)域，都是因為插入/缺失的存在，因為在indel附近的比對會出現(xiàn)大量的堿基錯配，這些堿基的錯配很容易被誤認(rèn)為SNP。還有，在比對過程中，比對算法對于每一條read的處理都是獨立的，不可能同時把多條reads與參考基因組比對來排錯。因此，即使有一些reads能夠正確的比對到indel，但那些恰恰比對到indel開始或者結(jié)束位置的read也會有很高的比對錯誤率，這都是需要重新比正確。Localrealignment就是將由indel導(dǎo)致錯配的區(qū)域進行重新比對，將indel附近的比對錯誤率降到最低。主要分為兩步：第一步，經(jīng)過運行RealignerTargetCreator來確定要進行重新比正確區(qū)域。e.g.java-jarGenomeAnalysisTK.jar-Rhg19.fa-TRealignerTargetCreator-Ihg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam-ohg19.dedup.realn_06.intervals-knownMills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf-known1000G_phase1.indels.hg19.vcf參數(shù)說明：-R：參考基因組；-T：選擇的\o"ViewallpostsinGATK"GATK工具；-I：輸入上一步所得bam文件；-o：輸出的需要重新比正確基因組區(qū)域結(jié)果；-maxInterval：允許進行重新比正確基因組區(qū)域的最大值，不能太大，太大耗費會很長時間，默認(rèn)值500；-known：已知的可靠的indel位點，指定已知的可靠的indel位點，重比對將主要圍繞這些位點進行，對于人類基因組數(shù)據(jù)而言，能夠直接指定\o"ViewallpostsinGATK"GATKresourcebundle里面的indel文件（必須是vcf文件）。對于knownsites的選擇很重要，\o"ViewallpostsinGATK"GATK中每一個用到knownsites的工具對于knownsites的使用都是不一樣的，可是所有的都有一個共同目的，那就是分辨真實的變異位點和不可信的變異位點。如果不提供這些knownsites的話，這些統(tǒng)計工具就會產(chǎn)生偏差，最后會嚴(yán)重影響結(jié)果的可信度。在這些需要知道knownsites的工具里面，只有UnifiedGenotyper和HaplotypeCaller對knownsites沒有太嚴(yán)格的要求。如果你所研究的對象是人類基因組的話，那就簡單多了，因為\o"ViewallpostsinGATK"GATK網(wǎng)站上對如何使用人類基因組的knownsites做出了詳細(xì)的說明，具體的選擇方法如下表，這些文件都能夠在\o"ViewallpostsinGATK"GATKresourcebundle中下載。TooldbSNP129dbSNP>132Millsindels1KGindelsHapMapOmniRealignerTargetCreatorXXIndelRealignerXXBaseRecalibratorXXX(UnifiedGenotyper/HaplotypeCaller)XVariantRecalibratorXXXXVariantEvalX

可是如果你要研究的不是人類基因組的話，那就有點麻煩了，，這個網(wǎng)站上是做非人類基因組時，大家分享的經(jīng)驗，能夠參考一下。這個knownsites如果實在沒有的話，也是能夠自己構(gòu)建的：首先，先使用沒有經(jīng)過矯正的數(shù)據(jù)進行一輪SNPcalling；然后，挑選最可信的SNP位點進行BQSR分析；最后，在使用這些經(jīng)過BQSR的數(shù)據(jù)進行一次真正的SNPcalling。這幾步可能要重復(fù)好多次才能得到可靠的結(jié)果。第二步，經(jīng)過運行IndelRealigner在這些區(qū)域內(nèi)進行重新比對。e.g.java-jarGenomeAnalysisTK.jar-Rhg19.fa-TIndelRealigner-targetIntervalshg19.dedup.realn_06.intervals-Ihg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam-ohg19.dedup.realn_07.bam-knownMills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf-known1000G_phase1.indels.hg19.vcf運行結(jié)束后，生成的hg19.dedup.realn_07.bam即為最后重比對后的文件。注意：1.第一步和第二步中使用的輸入文件（bam文件）、參考基因組和已知indel文件必須是相同的文件。2.當(dāng)在相同的基因組區(qū)域發(fā)現(xiàn)多個indel存在時，這個工具會從其中選擇一個最有可能存在比對錯誤的indel進行重新比對，剩余的其它indel不予考慮。3.對于454下機數(shù)據(jù)，本工具不支持。另外，這一步還會忽略bwa比對中質(zhì)量值為0的read以及在CIGAR信息中存在連續(xù)indel的reads。10.Basequalityscorerecalibration這一步是對bam文件里reads的堿基質(zhì)量值進行重新校正，使最后輸出的bam文件中reads中堿基的質(zhì)量值能夠更加接近真實的與參考基因組之間錯配的概率。這一步適用于多種數(shù)據(jù)類型，包括illunima、solid、454、CG等數(shù)據(jù)格式。在\o"ViewallpostsinGATK"GATK2.0以上版本中還能夠?qū)ndel的質(zhì)量值進行校正，這一步對indelcalling非常有幫助舉例說明，在reads堿基質(zhì)量值被校正之前，我們要保留質(zhì)量值在Q25以上的堿基，可是實際上質(zhì)量值在Q25的這些堿基的錯誤率在1%，也就是說質(zhì)量值只有Q20，這樣就會對后續(xù)的變異檢測的可信度造成影響。還有，在邊合成邊測序的測序過程中，在reads末端堿基的錯誤率往往要比起始部位更高。另外，AC的質(zhì)量值往往要低于TG。BQSR的就是要對這些質(zhì)量值進行校正。BQSR主要有三步：第一步：利用工具BaseRecalibrator，根據(jù)一些knownsites，生成一個校正質(zhì)量值所需要的數(shù)據(jù)文件，\o"ViewallpostsinGATK"GATK網(wǎng)站以“.grp”為后綴命名。e.g.java-jarGenomeAnalysisTK.jar-TBaseRecalibrator-Rhg19.fa-IChrALL.100.sam.dedup.realn.07.bam-knownSitesdbsnp_137.hg19.vcf-knownSitesMills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf-knownSites1000G_phase1.indels.hg19.vcf-oChrALL.100.sam.recal.08-1.grp第二步：利用第一步生成的ChrALL.100.sam.recal.08-1.grp來生成校正后的數(shù)據(jù)文件，也是以“.grp”命名，這一步主要是為了與校正之前的數(shù)據(jù)進行比較，最后生成堿基質(zhì)量值校正前后的比較圖，如果不想生成最后BQSR比較圖，這一步能夠省略。e.g.java-jarGenomeAnalysisTK.jar-TBaseRecalibrator-Rhg19.fa-IChrALL.100.sam.dedup.realn.07.bam-BQSRChrALL.100.sam.recal.08-1.grp-o\o"ViewallpostsinGATK"GATK/hg19.recal.08-2.grp-knownSitesdbsnp_137.hg19.vcf-knownSitesMills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf-knownSites1000G_phase1.indels.hg19.vcf第三步：利用工具PrintReads將經(jīng)過質(zhì)量值校正的數(shù)據(jù)輸出到新的bam文件中，用于后續(xù)的變異檢測。e.g.java-jarGenomeAnalysisTK.jar-TPrintReads-Rhg19.fa-IChrALL.100.sam.dedup.realn.07.bam-BQSRChrALL.100.sam.recal.08-1.grp-oChrALL.100.sam.recal.08-3.grp.bam主要參數(shù)說明：-bqsrBAQGOP：BQSRBAQgapopen罰值，默認(rèn)值是40，如果是對全基因組數(shù)據(jù)進行BQSR分析，設(shè)置為30會更好。-lqt：在計算過程中，該算法所能考慮的reads兩端的最小質(zhì)量值。如果質(zhì)量值小于該值，計算過程中將不予考慮，默認(rèn)值是2。注意：（1）當(dāng)bam文件中的reads數(shù)量過少時，BQSR可能不會正常工作，\o"ViewallpostsinGATK"GATK網(wǎng)站建議base數(shù)量要大于100M才能得到比較好的結(jié)果。（2）除非你所研究的樣本所得到的reads數(shù)實在太少，或者比對結(jié)果中的mismatch基本上都是實際存在的變異，否則必須要進行BQSR這一步。對于人類基因組，即使有了dbSNP和千人基因組的數(shù)據(jù)，還有很多mismatch是錯誤的。因此，這一步能做一定要做。

11.分析和評估BQSR結(jié)果這一步會生成評估前后堿基質(zhì)量值的比較結(jié)果，能夠選擇使用圖片和表格的形式展示。e.g.java-jarGenomeAnalysisTK.jar-TAnalyzeCovariates-Rhg19.fa-beforeChrALL.100.sam.recal.08-1.grp-afterChrALL.100.sam.recal.08-2.grp-csvChrALL.100.sam.recal.grp.09.csv-plotsChrALL.100.sam.recal.grp.09.pdf參數(shù)解釋：-before：基于原始比對結(jié)果生成的第一次校對表格。-after：基于第一次校對表格生成的第二次校對表格。-plots：評估BQSR結(jié)果的報告文件。-csv：生成報告中圖標(biāo)所需要的所有數(shù)據(jù)。

12.Reducebamfile這一步是使用ReduceReads這個工具將bam文件進行壓縮，生成新的bam文件，新的bam文件依然保持bam文件的格式和所有進行變異檢測所需要的信息。這樣不但能夠節(jié)省存儲空間，也方便后續(xù)變異檢測過程中對數(shù)據(jù)的處理。e.g.java-jarGenomeAnalysisTK.jar-TReduceReads-Rhg19.fa-IChrALL.100.sam.recal.08-3.grp.bam-oChrALL.100.sam.recal.08-3.grp.reduce.bam到此為止，\o"ViewallpostsinGATK"GATK流程中的第一大步驟就結(jié)束了，完成了variantscalling所需要的所有準(zhǔn)備工作，生成了用于下一步變異檢測的bam文件。變異檢測1.VariantCalling\o"ViewallpostsinGATK"GATK在這一步里面提供了兩個工具進行變異檢測——UnifiedGenotyper和HaplotypeCaller。其中HaplotypeCaller一直還在開發(fā)之中，包括生成的結(jié)果以及計算模型和命令行參數(shù)一直在變動，因此，當(dāng)前使用比較多的還是UnifiedGenotyper。此外，HaplotypeCaller不支持Reduce之后的bam文件，因此，當(dāng)選擇使用HaplotypeCaller進行變異檢測時，不需要進行Reducereads。UnifiedGenotyper是集合多種變異檢測方法而成的一種VariantsCaller，既能夠用于單個樣本的變異檢測，也能夠用于群體的變異檢測。UnifiedGenotyper使用貝葉斯最大似然模型，同時估計基因型和基因頻率，最后對每一個樣本的每一個變異位點和基因型都會給出一個精確的后驗概率。e.g.java-jarGenomeAnalysisTK.jar-glmBOTH-lINFO-Rhg19.fa-TUnifiedGenotyper-IChrALL.100.sam.recal.08-3.grp.reduce.bam-Ddbsnp_137.hg19.vcf-oChrALL.100.sam.recal.10.vcf-metricsChrALL.100.sam.recal.10.metrics-stand_call_conf10-stand_emit_conf30上述命令將對輸入的bam文件中的所有樣本進行變異檢測，最后生成一個vcf文件，vcf文件中會包含所有樣本的變異位點和基因型信息?？墒乾F(xiàn)在所得到的結(jié)果是最原始的、沒有經(jīng)過任何過濾和校正的Variants集合。這一步產(chǎn)生的變異位點會有很高的假陽性，特別是indel，因此，必須要進行進一步的篩選過濾。這一步還能夠指定對基因組的某一區(qū)域進行變異檢測，只需要增加一個參數(shù)-L：target_interval.list，格式是bed格式文件。主要參數(shù)解釋：-A：指定一個或者多個注釋信息，最后輸出到vcf文件中。-XA：指定不做哪些注釋，最后不會輸出到vcf文件中。-D：已知的snp文件。-glm：選擇檢測變異的類型。SNP表示只進行snp檢測；INDEL表示只對indel進行檢測；BOTH表示同時檢測snp和indel。默認(rèn)值是SNP。-hets：雜合度的值，用于計算先驗概率。默認(rèn)值是0.001。-maxAltAlleles：容許存在的最大altallele的數(shù)目，默認(rèn)值是6。這個參數(shù)要特別注意，不要輕易修改默認(rèn)值，程序設(shè)置的默認(rèn)值幾乎能夠滿足所有的分析，如果修改了可能會導(dǎo)致程序無法運行。-mbq：變異檢測時，堿基的最小質(zhì)量值。如果小于這個值，將不會對其進行變異檢測。這個參數(shù)不適用于indel檢測，默認(rèn)值是17。-minIndelCnt：在做indelcalling的時候，支持一個indel的最少read數(shù)量。也就是說，如果同時有多少條reads同時支持一個候選indel時，軟件才開始進行indelcalling。降低這個值能夠增加indelcalling的敏感度，可是會增加耗費的時間和假陽性。-minIndelFrac：在做indelcalling的時候，支持一個indel的reads數(shù)量占比對到該indel位置的所有reads數(shù)量的百分比。也就是說，只有同時滿足-minIndelCnt和-minIndelFrac兩個參數(shù)條件時，才會進行indelcalling。-onlyEmitSamples：當(dāng)指定這個參數(shù)時，只有指定的樣本的變異檢測結(jié)果會輸出到vcf文件中。-stand_emit_conf：在變異檢測過程中，所容許的最小質(zhì)量值。只有大于等于這個設(shè)定值的變異位點會被輸出到結(jié)果中。-stand_call_conf：在變異檢測過程中，用于區(qū)分低質(zhì)量變異位點和高質(zhì)量變異位點的閾值。只有質(zhì)量值高于這個閾值的位點才會被視為高質(zhì)量的。低于這個質(zhì)量值的變異位點會在輸出結(jié)果中標(biāo)注LowQual。在千人基因組計劃第二階段的變異檢測時，利用35x的數(shù)據(jù)進行snpcalling的時候，當(dāng)設(shè)置成50時，有大概10%的假陽性。-dcov：這個參數(shù)用于控制檢測變異數(shù)據(jù)的coverage(X)，4X的數(shù)據(jù)能夠設(shè)置為40，大于30X的數(shù)據(jù)能夠設(shè)置為200。注意：\o"ViewallpostsinGATK"GATK進行變異檢測的時候，是按照染色體排序順序進行的（先callchr1，然后chr2，然后chr3…最后chrY），并非多條染色體并行檢測的，因此，如果數(shù)據(jù)量比較大的話，建議分染色體分別進行，對性染色體的變異檢測能夠同常染色體方法。大多數(shù)參數(shù)的默認(rèn)值能夠滿足大多數(shù)研究的需求，因此，在做變異檢測過程中，如果對參數(shù)意義不是很明確，不建議修改。2.對原始變異檢測結(jié)果進行過濾（hardfilterandVQSR）這一步的目的就是對上一步call出來的變異位點進行過濾，去掉不可信的位點。這一步能夠有兩種方法，一種是經(jīng)過\o"ViewallpostsinGATK"GATK的VariantFiltration，另一種是經(jīng)過\o"ViewallpostsinGATK"GATK的VQSR（變異位點質(zhì)量值重新校正）進行過濾。經(jīng)過\o"ViewallpostsinGATK"GATK網(wǎng)站上提供的最佳方案能夠看出，\o"ViewallpostsinGATK"GATK是推薦使用VASR的，但使用VQSR數(shù)據(jù)量一定要達(dá)到要求，數(shù)據(jù)量太小無法使用高斯模型。還有，在使用VAQR時，indel和snp要分別進行。VQSR原理介紹：這個模型是根據(jù)已有的真實變異位點（人類基因組一般使用HapMap3中的位點，以及這些位點在Omni2.5MSNP芯片中出現(xiàn)的多態(tài)位點）來訓(xùn)練，最后得到一個訓(xùn)練好的能夠很好的評估真?zhèn)蔚腻e誤評估模型，能夠叫她適應(yīng)性錯誤評估模型。這個適應(yīng)性的錯誤評估模型可以應(yīng)用到call出來的原始變異集合中已知的變異位點和新發(fā)現(xiàn)的變異位點，進而去評估每一個變異位點發(fā)生錯誤的概率，最終會給出一個得分。這個得分最后會被寫入vcf文件的INFO信息里，叫做VQSLOD，就是在訓(xùn)練好的混合高斯模型下，一個位點是真實的概率比上這個位點可能是假陽性的概率的logoddsratio（對數(shù)差異比），因此，能夠定性的認(rèn)為，這個值越大就越好。VQSR主要分兩個步驟，這兩個步驟會使用兩個不同的工具：VariantRecalibrator和ApplyRecalibrati