細(xì)胞生物學(xué)課件2 細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)

第二章

細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)本章內(nèi)容提要第一節(jié)顯微技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)第三節(jié)細(xì)胞組份的分級分離第四節(jié)細(xì)胞內(nèi)分子的示蹤技術(shù)第五節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)第六節(jié)常見模式生物第一節(jié)顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡—、光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡1.構(gòu)成：①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡放大成虛像。顯微鏡的構(gòu)造及使用StructureofMicroscopeLightPathwayofMicroscope(1)分辨率(resolution，R)顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處，能分辨被檢物體微細(xì)結(jié)構(gòu)最小間隔的能力。

0.61λR＝

n·sinθ光學(xué)顯微鏡的參數(shù)

0.61λR＝

n·sinθ

n:聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率.

空氣為1,油為1.5θ:標(biāo)本對物鏡鏡口張角的半角.sinθ的最大值為1λ:照明光源的波長.

白光為0.5μm

顯微鏡分辨率計算：

R＝0.61/n·sin

＝0.61×0.5m/1.5×1

＝0.2m人眼的分辨率：100m典型的動物細(xì)胞：10～20m一般的細(xì)菌和線粒體：0.5m(2)最大放大倍數(shù)人眼的分辨率(～100m)光鏡的分辨率(～0.2m)

=～500倍(3)光學(xué)顯微鏡總放大倍數(shù)

物鏡放大倍數(shù)×

目鏡放大倍數(shù)（二）熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點：光源為短波光；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。原理:

熒光分子在受到光照射后，可吸收特定波長的短波光線，并發(fā)射出比原來吸收波長更長的光。可見光紫外光紅外光shortlongλ

基本構(gòu)造：

A光源

B二向色鏡：反射短波光線，透過長波光線

C一組濾光片：得到純的激發(fā)光和發(fā)射光

熒光顯微鏡基本原理熒光的觀察1.自發(fā)熒光某些天然物質(zhì)本身能發(fā)出熒光，如葉綠素。2.二次熒光

非熒光性物質(zhì)用熒光色素染色后，可產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便于進(jìn)行觀察

。3.抗體熒光技術(shù)

帶熒光標(biāo)記的抗體與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，這樣就能通過抗體結(jié)合的熒光觀察到抗原。4.綠色熒光蛋白"forthediscoveryanddevelopmentofthegreenfluorescentprotein,GFP".綠熒光水母——通過體內(nèi)綠色熒光蛋白發(fā)光下村修植物細(xì)胞微管植物個體帶綠黃紅熒光蛋白的魚帶GFP的小鼠Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。圖示：鼠主動脈平滑肌的熒光染色。核:blue線粒體:green肌動蛋白:red

（三）激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描；能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)；分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍；用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSM激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/分辨率：因激光束波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨率，約是普通光鏡的3倍。應(yīng)用：觀察細(xì)胞形態(tài)統(tǒng)計光密度來定量細(xì)胞內(nèi)成分三維重建熒光顯微鏡激光共聚焦顯微鏡（四）暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，物體邊緣是亮的?？捎^察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。（五）相差顯微鏡把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。原理明視野相差光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本。（六）偏光顯微鏡polarizingmicroscope用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（與起偏器方向垂直的偏振片）。載物臺可以旋轉(zhuǎn)。淀粉（七）微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。（八）倒置顯微鏡inversemicroscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的還具有熒光裝置。

倒置顯微鏡正置顯微鏡（九）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢采用組合方式，集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體；自動化與電子化。二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM透射電子顯微鏡分辨率

理論上d=0.002nm

實際上d=0.1nm

生物標(biāo)本d=2nm放大倍率1,000,000透射電鏡光學(xué)顯微鏡透射電鏡的成像原理電子束通過標(biāo)本時，根據(jù)標(biāo)本各部位密度的不同，部分電子發(fā)生散射，只有剩余的電子成像，經(jīng)物鏡和投射鏡放大后投射到照相底片或熒屏上。由于散射的電子不參加成像，故標(biāo)本中密度大的部分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)；相反密度小的部分散射電子少而形成明區(qū)。透射電鏡生物標(biāo)本制備過程2.制樣技術(shù)1）超薄切片超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機（ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。2）負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria3）冰凍蝕刻freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。anonionroottipcellwithnoetching.斷面的三種處理方法：蝕刻（etching）、不蝕刻（noetching）、深度蝕刻（deepetching）培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示

Clathrin衣被電鏡三維重建技術(shù)(二)掃描電子顯微鏡Scanningelectronmicroscope（SEM）成

像

原

理SEMLIGHTPATHWAY工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。a.樣品表面形貌表面越突出，圖像越亮表面越凹陷，圖像越暗b.樣品與集電器的關(guān)系面向集電器，圖像越亮背向集電器，圖像越暗A(chǔ).原理二次電子B.分辨率

3-10nmC.樣品的制備*固定*干燥（臨界點干燥）*染色（離子濺射鍍膜）D.應(yīng)用標(biāo)本表面的三維結(jié)構(gòu)掃描電鏡的特點高的分辨率很強的立體感放大倍率范圍廣人類紅細(xì)胞酵母人類精子（三）掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根據(jù)隧道效應(yīng)設(shè)計，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向為0.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.01nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。掃描隧道顯微鏡原理引自http://www.iap.tuwien.ac.atSTMimageofaDNAmoleculeSchematicdrawingofAFM三、顯微操作技術(shù)

micromanipulationtechnique是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，1952年，Briggs和King等將不同階段的蛙胚細(xì)胞核注入去核的蛙卵，構(gòu)建核移植胚。Gordon（1962）證明原腸胚以后的細(xì)胞核移植能發(fā)育到成體。1997年，Wilmut等克隆了綿羊Dolly。顯微操作儀轉(zhuǎn)基因顯微操作過程

第二節(jié)

細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)1.細(xì)胞分離（cellseparation）(1)制備單一細(xì)胞懸液組織

EDTA細(xì)胞間連接

消化

胰酶細(xì)胞外基質(zhì)多細(xì)胞懸液(2)分離不同類型細(xì)胞A.離心（centrifugation）

大小密度形狀

小輕不規(guī)則大重圓形B.細(xì)胞的黏附性C.親和性表面①②

輕微震蕩消化基質(zhì)D.流式細(xì)胞儀(flowcytometer,FCM)

熒光激活細(xì)胞分選儀（FACS）

原理：

用帶有熒光的特異抗體標(biāo)記待分離的細(xì)胞，然后在流式細(xì)胞儀中選出標(biāo)記細(xì)胞。應(yīng)用：細(xì)胞分選:1cellin10005000cells/sec流式細(xì)胞儀E.激光捕捉顯微切割技術(shù)

(Lasercapturemicrodissection,LCM)原理：應(yīng)用：從組織切片中獲取單一細(xì)胞2.細(xì)胞培養(yǎng)（Cellculture）從活體組織分離出特定細(xì)胞,在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng),使之能夠繼續(xù)生存、生長以至增殖的一種方法。

invivo：用動物做實驗

invitro：用培養(yǎng)細(xì)胞做實驗

(1)細(xì)胞培養(yǎng)的條件A.固體表面B.培養(yǎng)基、血清C.無菌、抗生素D.37℃、5％CO2

、95～100％濕度(2)細(xì)胞培養(yǎng)的不同階段

原代培養(yǎng)(primaryculture)

傳代培養(yǎng)(secondaryculture)傳代細(xì)胞系（Cellline）成功篩選細(xì)胞株（cellstrain）原代培養(yǎng)(primaryculture):直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)(secondaryculture)：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞連續(xù)以一定比例擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞系(cellline)：原代培養(yǎng)細(xì)胞成功傳代即為細(xì)胞系。細(xì)胞株（cellstrain）：從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。

功能：保持原分化特性形態(tài)：多不保持原有細(xì)胞形態(tài)成纖維樣細(xì)胞

上皮樣細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的特點：（１）變異細(xì)胞

可無限增殖、傳代

細(xì)胞系（NIH3T3:1963年由小鼠成纖維細(xì)胞建立）

接觸抑制:細(xì)胞系在固體表面生長繁殖,在互相接觸后,即培養(yǎng)皿長滿一單層細(xì)胞后停止分裂、增殖。細(xì)胞系的來源：

（２）由癌細(xì)胞建立的“癌細(xì)胞系”

特點:可在培養(yǎng)皿中以極高的密度增殖，沒有擴(kuò)展的余地時,可向空間生長。

（３）正常細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)建立的“轉(zhuǎn)化細(xì)胞系”腫瘤病毒放射線化學(xué)致癌物用癌基因轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞293人腎上皮細(xì)胞HepG2人肝癌細(xì)胞Jurkat急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞ES人胚胎干細(xì)胞人神經(jīng)細(xì)胞人視網(wǎng)膜細(xì)胞(3)細(xì)胞克隆（Cellcloning）克?。╟lone）：指由同一個祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。

群體培養(yǎng)（massculture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合(confluence)后形成均勻的單細(xì)胞層；

克隆培養(yǎng)（clonalculture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長，每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，稱為克隆。(4)細(xì)胞融合在自然或人工條件下，使二個或二個以上細(xì)胞合并形成一個細(xì)胞的過程。①定義

生物學(xué)方法：仙臺病毒化學(xué)方法：PEG(聚乙二醇)

物理方法：電脈沖打孔儀②促融方法③應(yīng)用A.細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間的相互作用

雞紅細(xì)胞組織培養(yǎng)細(xì)胞融合紅細(xì)胞開始合成RNA,并進(jìn)行DNA復(fù)制細(xì)胞周期相關(guān)因子的發(fā)現(xiàn)B.膜蛋白流動性C.基因定位D.單克隆抗體制備

（monoclonalantibody）

單一的抗原一個B淋巴細(xì)胞特異性抗體

單克隆抗體定義:

從單個B淋巴細(xì)胞繁殖的細(xì)胞克隆可以得到均質(zhì)的抗體叫單克隆抗體。單克隆抗體制備過程：

B淋巴細(xì)胞＋“不死的”小鼠骨髓瘤細(xì)胞

雜交細(xì)胞（雜交瘤）

B淋巴細(xì)胞(產(chǎn)生特異性抗體)

腫瘤細(xì)胞(在體外無限增殖)將每個雜交瘤細(xì)胞分別增殖，就得到很多單一細(xì)胞的克隆，一個克隆可以產(chǎn)生一種特異性單克隆抗體。單克隆抗體制備過程："fortheoriesconcerningthespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystemandthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies".第三節(jié)

細(xì)胞組分的分級分離1.超速離心—

細(xì)胞器、大分子

制備細(xì)胞勻漿細(xì)胞勻漿液膜細(xì)胞器大分子

方法：●低滲透壓●超聲振蕩●在細(xì)胞膜上打孔●強制通過微孔●機械破碎或研磨⑴.差速離心法:用于分離大小、形狀顯著不同

的組分，根據(jù)顆粒沉降速度不同得以分離.⑵.速度沉降用途:分離密度相近而大小形狀略有差異的組分原理：制備梯度離心介質(zhì),分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。梯度特點:梯度平緩，密度較低(5%-20%)，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。分離效率:取決于沉降系數(shù)間的差異。速度沉降⑶.平衡沉降（等密度沉淀）用途：分離大小、形態(tài)相似而密度不同的組分。

原理：制備梯度離心介質(zhì)，樣品各成分在梯度介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的成分分離。特點：介質(zhì)密度高，陡度大(20%-70%）介質(zhì)最低密度大于被分離組分的最大密度。分離效率:取決于浮力密度間的差異。平衡沉降DNA半保留復(fù)制的實驗證據(jù)2.層析—

分離蛋白質(zhì)(1)分配層析紙層析薄層層析⑵柱層析

—

分離蛋白質(zhì)A.離子交換層析B.凝膠過濾層析

電荷大小C.親和層析D.疏水性層析

親和疏水性

基質(zhì)＋抗體基質(zhì)＋疏水基團(tuán)⑶高壓液相層析(HPLC）基質(zhì)粒度小分辨率高分離速度快4.電泳—

分析蛋白質(zhì)、核酸

(1)原理氨基酸帶有正、負(fù)電荷，因此蛋白質(zhì)往往帶有凈正電荷或負(fù)電荷。將含有蛋白質(zhì)的溶液加上電場，蛋白質(zhì)分子就會按照它們的凈電荷的多少、大小及形狀的不同在電場中移動，這一技術(shù)稱為電泳。

大小電荷形狀(2)SDS

—

根據(jù)蛋白質(zhì)分子量、亞單位組成*

樣品處理:SDS(十二烷基硫酸鈉)2-巰基乙醇(2-ME)/二硫蘇糖醇(DTT)*支持體:單體丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝膠*染色:考馬斯亮藍(lán)特異性蛋白(westernblotting)√蛋白質(zhì)樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變

Western印跡技術(shù)將經(jīng)聚丙稀酰胺凝膠分離的蛋白帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,然后將膜與特異性抗體作用,膜上特定蛋白條帶將與抗體結(jié)合,并進(jìn)一步與酶標(biāo)記二抗反應(yīng),最終以發(fā)色底物顯色而被檢測.

基本步驟:(1)SDS(2)轉(zhuǎn)膜

(3)抗體反應(yīng)一抗孵育標(biāo)記二抗孵育

(4)顯色⑶等電聚焦電泳等電聚焦（isoelectrofocusing）,IEF

利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。利用等電聚焦技術(shù)分離、分析的對象僅限于蛋白質(zhì)和兩性分子。根據(jù)建立pH梯度的原理不同，梯度有分為載體兩性電解質(zhì)梯度（CarrierampholytespHgradient）和固相梯度。135等電聚焦電泳

利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場作用下沿電場方向在凝膠內(nèi)制造一個pH梯度。每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI相一致的pH處。⑷.雙向電泳—蛋白質(zhì)分子量、等電點原理：等電聚焦:等電點

SDS:分子量5.質(zhì)譜技術(shù)原理：通過測定樣品離子的質(zhì)/荷比來進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。應(yīng)用：蛋白質(zhì)鑒定（2002年諾貝爾化學(xué)獎獲得者）第四節(jié).

細(xì)胞內(nèi)分子的示蹤技術(shù)

1.同位素示蹤技術(shù)——放射自顯影術(shù)(autoradiography)

將放射性前體物質(zhì)摻入細(xì)胞，使放射性分子和細(xì)胞內(nèi)原有的未標(biāo)記分子混和，因它們的化學(xué)性質(zhì)相同,細(xì)胞就會不加分辨地利用。

●放射性化合物滲入活細(xì)胞●培養(yǎng)后取樣、固定,進(jìn)行光鏡或電鏡切片●在暗處把感光乳膠覆蓋于切片上，存放在暗處●在此期間,放射性同位素衰變使乳膠曝光后顯影及定影。根據(jù)銀粒所在部位，就可知道細(xì)胞中放射性物質(zhì)的分布。具體操作過程A.細(xì)胞內(nèi)生物大分子的定性、定位與半定量

蛋白質(zhì)——放射性同位素標(biāo)記的

氨基酸

核酸——放射性同位素標(biāo)記的

堿基舉例

分泌蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位①將胰島β細(xì)胞與3H-亮氨酸共同孵育5分鐘，②用未標(biāo)記的亮氨酸沖洗。③在暗處把感光乳膠覆蓋在切片上存放數(shù)日。④放射性同位素衰變使乳膠感光，經(jīng)過顯影和定影，根據(jù)感光乳膠黑色銀顆粒所在位置即可知道細(xì)胞中放射物質(zhì)的分布情況。B.示蹤細(xì)胞中幾乎所有的過程對放射性分子在細(xì)胞內(nèi)存在部位和化學(xué)形式進(jìn)行追蹤，就可測定放射性分子進(jìn)入細(xì)胞后不同時間所在的位置和化學(xué)變化（光合作用）。舉例：分泌蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成、運輸及分泌舉例：DNA和RNA在細(xì)胞內(nèi)合成過程用3H-胸苷、3H-尿苷滲入細(xì)胞

DNA在細(xì)胞核中合成RNA在細(xì)胞核中合成并保留在核內(nèi)很快累積于細(xì)胞質(zhì)中

2.抗體示蹤技術(shù)A.抗體+熒光素LM(免疫熒光顯微鏡)B.抗體+膠體金EM(免疫電鏡)C.ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)

抗體＋酶酶酶底物顯色第五節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—克隆DNA片斷

(polymerasechainreaction，PCR)