第七章蛋白質(zhì)分分離純化和表征

1蛋白質(zhì)的分離、純化和表征第7章P291一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子中有很多酸性和堿性解離基團，是具有兩性解離性質(zhì)的化合物。各種解離基團的解離度與溶液的pH有關(guān)，pH越低，堿性解離度越大，蛋白質(zhì)分子帶正電荷越多，負電荷越少；pH升高，則解離情況相反。

在特定pH條件下，某種蛋白質(zhì)分子所帶正負電荷相等，靜電荷為零，這一pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點（pI）。蛋白質(zhì)的等電點有中性鹽時，蛋白質(zhì)等電點在一定程度上決定于介質(zhì)中離子的組成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可與蛋白質(zhì)某些可解離基團結(jié)合，影響等電點。無鹽類干擾時，蛋白質(zhì)分子本身的質(zhì)子供體基團解離出來的質(zhì)子數(shù)與它的質(zhì)子受體基團結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的溶液pH稱為等離子點(isoionicpoint,或稱等離點)。等離子點是每種蛋白質(zhì)的一個特征常數(shù)。幾種蛋白質(zhì)等電點二、蛋白質(zhì)的分子大小與分子量的測定蛋白質(zhì)的分子量的范圍:6×103～1×106Da（一）根據(jù)化學組成測定最低相對分子量

用化學分析方法測出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量。并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中含有一個被測元素的原子，則可由此計算出蛋白質(zhì)的最低分子量。

例：肌紅蛋白和血紅蛋白含鐵量均為0.335%,計算二者的相對分子質(zhì)量。

最低相對分子量＝x100=鐵的百分含量鐵的原子量0.33555.8x100=16700測定蛋白質(zhì)相對分子量的原理和方法也可以利用蛋白質(zhì)中含量特少的aa，用同樣的原理計算蛋白質(zhì)的最低分子量。（二）滲透壓法測定相對分子量

滲透壓法測定Mr操作簡單，Mr在10-100kDa時較準，但不能區(qū)別蛋白質(zhì)分子是否均一。滲透壓公式：Mr

=RTlimc→0πc(c=質(zhì)量濃度，g/mol)（三）沉降分析測定Mr超速離心機最大轉(zhuǎn)速:60000～80000r/min,相當于位于距轉(zhuǎn)軸中心10cm處、單位質(zhì)量(1g)分子所受到的離心力(離心場強度)為400000×g～700000×g.沉降速度與蛋白質(zhì)分子大小、密度和形狀有關(guān),且與溶劑密度和黏度有關(guān).單位離心場強度的沉降速度稱為沉降系數(shù),用s(小寫)表示:

蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒等的沉降系數(shù)介于1×10－13到200×10－13秒之間。為了使用方便，以10－13秒為一個沉降系數(shù)的單位，稱為斯維得貝格單位（Svedbergunit），或稱沉降系數(shù)單位，用S表示。如人血紅蛋白的S為4.46×10－13秒，即4.46S。

蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)(s)與相對分子質(zhì)量(Mr)的關(guān)系可用斯維得貝格方程表達:摩爾氣體常數(shù)(8.314J·K-1·mol-1);熱力學溫度(K),舊稱絕對溫度蛋白質(zhì)的擴散系數(shù)(cm2/s),數(shù)值上等于當濃度梯度為1個單位時在1s內(nèi)通過1cm2面積的蛋白質(zhì)質(zhì)量溶劑的密度(g/cm3)偏微比體積(cm3/g)又稱偏微比容,蛋白質(zhì)溶于水的偏微比容約0.74cm3/g沉降系數(shù)（四）凝膠過濾法測定Mr

凝膠過濾（層析）可按照蛋白質(zhì)分子量大小進行分離的技術(shù)，同時可以測定蛋白質(zhì)分子量。蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):先測得幾種標準蛋白質(zhì)的Ve（Ve為洗脫體積），并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測V測（五）SDS法測定Mr

聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關(guān)。當電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。

SDS破壞蛋白氫鍵和疏水相互作用,巰基乙醇能打開二硫鍵,SDS和巰基乙醇存在下,單體蛋白或亞基(寡聚蛋白質(zhì)解離成亞基)處展開狀態(tài).SDS烴鏈與蛋白質(zhì)側(cè)鏈通過疏水相互作用形成復合體.在一定條件下,SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比:1.4gSDS/1g蛋白質(zhì),相當于每兩分子氨基酸殘基結(jié)合一分子SDS.SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后:第一,SDS陰離子使多肽鏈覆蓋上相同密度的負電荷,遠超過蛋白質(zhì)原有電荷量,掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別;第二,改變蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象,使大多數(shù)蛋白質(zhì)采取類似的形狀.因此在SDS存在下的電泳幾乎是完全基于相對分子質(zhì)量分離蛋白質(zhì)的.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）SDS，遷移率不受蛋白質(zhì)原有的電荷、分子形狀等因素影響,但凝膠具分子篩效應.因此，遷移率與相對分子質(zhì)量(Mr)之關(guān)系:常數(shù)相對遷移率：樣品遷移距離/前沿(染料)蛋白質(zhì)親水膠體的穩(wěn)定性主要取決于兩個因素：雙電層水化層三、膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀1．蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)顆粒大小屬于膠體粒子的范圍(1-100nm)。又由于其分子表面有許多極性基團，親水性極強，易溶于水成為穩(wěn)定的親水膠體溶液。

蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的，相對的。假若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和雙電層，蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮結(jié)沉淀現(xiàn)象，這既是所謂的蛋白質(zhì)沉淀作用。①鹽析法（saltingout）：中性鹽（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→蛋白質(zhì)脫去水化層。

優(yōu)點：不引起蛋白質(zhì)變性。鹽溶（saltingin）：稀鹽溶液中蛋白質(zhì)溶解度增加的現(xiàn)象。2．蛋白質(zhì)的沉淀②有機幸溶劑津沉淀府法：極性朽有機臥溶劑城（甲側(cè)醇，擁乙醇圓，丙命酮）釀→脫汁去水邀化層著以及會降低嚷介電拜常數(shù)德而腐增加主帶電調(diào)質(zhì)點更間的獲相互還作用帽。條件兼：低雞溫操勢作，斗縮短肺時間蘿。③席重金候?qū)冫}狡沉淀龍法:當溶遷液pH偽>p丸I,蛋白夕質(zhì)顆接粒帶稀負電糕荷,易與主重金雞屬離牙子(H潤g2+,P衡b2+,C兔u2+,A襯g+等)?！捎钩恋沓?。④晶生物孟堿試錯劑和鞏某些酬酸類推沉淀稿法:生物李堿試故劑—能引訊起生盜物堿琴沉淀布的一宮類試精劑。志當萬溶液pH怖<p油I時,蛋白燦質(zhì)顆芳粒帶棄正電奪荷→列易賀與生敢物堿煎試劑,酸根知負離妥子反寬應→劫沉淀用途掏：臨燙床除獻去體壓液中極干擾辭測定社的蛋膀白質(zhì)⑤加熱淋變性攤沉淀布法原因陰：加將熱變沸性使副蛋白鐘質(zhì)天眠然結(jié)梳構(gòu)解蹄體，郵疏水健基外缸露，靜損壞姥了水極化層與用嘩途：貓制豆睬腐（仍加熱+少量再鹽鹵溪）四、蛋白辛質(zhì)分供離純濁化的災一般卸原則前處絲式理：遷細胞振破碎粗分露級分絞離：驅(qū)鹽析滋、等憐電點提沉淀刑、有錄機溶勻劑沉麻淀等細分喚級分望離：側(cè)層析劃、電安泳、箱結(jié)晶蛋白菜質(zhì)純虎化測攏總目桐標：沈增加純度態(tài)或比刮活力動物漫材料綠剔除梳結(jié)締恒組織販、脂奇肪組墻織;種子肢材料活應先勉去殼扒和種蝦皮以煩免受值單寧雨等物句質(zhì)的爺污染,油料悼種子粥脫脂.選擇潮適當蜜方法,破碎給組織贈或細誕胞：曲動物沖組織(電動盡搗碎滋機或橋勻漿備器或僅超聲);植物賓組織(英砂忽或玻犬璃粉半和適鑼當?shù)男彌_干液研監(jiān)磨或?qū)矣美w維望素酶);細菌言細胞(超聲,與砂澇研磨譯或溶菌宵酶).選擇病適當景的緩忍沖液逗把所鬼要的輩蛋白賓質(zhì)提導取出灣來.如果安蛋白績質(zhì)是預與細就胞膜橡或膜框質(zhì)細瓦胞器碌結(jié)合課的,用超咬聲波域或去天污劑顛使膜母結(jié)構(gòu)拜解聚,用適顯當?shù)年兘橘|(zhì)臘提取求。前處連理:五、蛋白削質(zhì)分藏離純鞭化的一般壇方法根據(jù)將分子汽量：河如沉家降速葬度法腎離心根據(jù)處密度菌：沉紫降平晶衡法趟離心根據(jù)蛙電荷閣和分素子量祝：聚鑄丙烯鑰酰胺紀凝膠柏電泳根據(jù)株分子筒量和匪分子排形狀先：凝父膠過能濾根據(jù)愚溶解療度：勞硫酸椒銨分膽級沉領(lǐng)淀、測有機跑溶劑將分級擇沉淀根據(jù)家電荷暈：等灘電點翠沉淀透析：利橡用半病透膜噸的選挑擇通塌透性彩來純泄化象庫蛋白叫質(zhì)這熊樣的委大分培子物吳質(zhì)的月過程尿叫透梁析。超過拐濾：是鋼利用執(zhí)壓力升或離語心力展，強閘行使催水和氣其他呼小分子扯而蛋白贊質(zhì)分帽子被閉截留鹽在膜令上，階以達吉到濃腐縮和蛋脫鹽丘的目請的，圾有時跑要用鑄切向砍流過舉濾法量。（一弟）根雪據(jù)分襲子大跌小不眾同的惜分離免純化功方法磁力步攪拌機器透析磨液裝有綠蛋白碰溶液逃的透鬼析袋攪拌客子透析剝超濾離心歷技術(shù)風主要胡用于號各種毅生物瓜樣品單的分戶離和猛制備團，生抗物樣柴品懸乓浮液惕在高春速旋間轉(zhuǎn)下取，由役于巨走大的處離心柴力作慮用，近使懸橫浮的臟微小足顆粒芝（細掌胞器痰、生牧物大事分子貍的沉健淀等源）以仗一定開的速琴度沉漲降，盯從而猜與溶退液得喜以分湊離，瘋而沉繭降速遷度取例決于查顆粒術(shù)的質(zhì)扮量、疏大小禽和密飾度。密度社梯度錘離心哪技術(shù)裙是利懷用每軟種蛋壯白質(zhì)皆顆粒大沉降劉到與秀自身殃密度敘相等偷的密鉗度梯抓度時順即停比止不癥前，診最后蛋各種暗蛋白世質(zhì)在磨離心奮管中符被分直離成類各自很的區(qū)叢帶。常用墾的密們度梯融度有賄蔗糖掃梯度窮，聚司蔗糖叨梯度辱等。密度掠梯度蜂（區(qū)貸帶）挪離心常用概于生回成密鑒度梯雁度的首介質(zhì)愁是蔗晴糖、饑聚蔗捷糖（Fi遠co斷l(xiāng)l），王分離海核酸伐時還堂常用Cs策Cl作為機介質(zhì)厭。凝膠鋼過濾判法常用列凝膠仁：交符聯(lián)葡乏聚糖索、聚丙狀烯酰驕胺凝男膠，洪瓊脂檢糖（se講ph考ar地os雜e或Bi溉o-仔Ge農(nóng)l芳A）；凝膠虹網(wǎng)孔蹤蝶大小頃一定列，只潤允許鄉(xiāng)豐相應示大小挨的分把子進邊入凝清膠顆片粒內(nèi)張部，足大分曠子則箱被排船阻在睬外，淋即分級分剖離范僚圍或記排阻茅極限;大分封子從延顆粒稿間隙狼流下及來，號洗脫砍液體庫積小板。小蓄分子死在顆漸粒網(wǎng)級狀結(jié)遲構(gòu)洗死脫歷右程長叔，后射洗脫查下來椅，洗老脫體閉積大刻；用洗私脫體嬸積同死標準板分子躲量的押蛋白用質(zhì)的膏比例脖關(guān)系鐮測定哭蛋白犯質(zhì)分厚子量短；（二滾）利膏用溶瀉解度對差別蛾的純予化方翁法影響蛋白躁質(zhì)溶耐解度運的外賴部因拐素很樹多，線其中茄主要歲有：談溶液聽的pH、離凳子強經(jīng)度、鹽介電義常數(shù)西和溫押度。銷溶解增度歸仇根結(jié)潔底取湖決于王他們幟本身縫的分項子結(jié)終構(gòu)。1.通過粗改變召溶液pH值的紀等電紅點沉伐淀法2.通過主改變哀溶液板離子林強度催的鹽刪析、夢鹽溶3.有機輔溶劑報的分草級沉渣淀4.通過投改變魔溫度歷的沉佳淀法在等騾電點pH條件胳下，萬蛋白荒質(zhì)為鏈電中死性，植其物企理性作質(zhì)如脅導電便性、域溶解體度、鮮黏度撕、滲莖透壓頁等都夕表現(xiàn)乞為最眉低值烘，易搭發(fā)生債絮結(jié)島沉淀竭。因比此，受等電緣瑞點性拌質(zhì)常梯被用元于蛋千白質(zhì)澡的分懼離制拒備，聽被稱男為等提電點桐沉淀恰技術(shù)盾。等電兩點沉將淀鹽溶份與鹽能析鹽溶熄：一這般在耍低鹽廈濃度敞的情雪況下繩，蛋鵲白質(zhì)厘的溶鹽解度遼隨鹽倘濃度授的升貴高而輔增加催，這緞種現(xiàn)禁象稱鑒為鹽溶；鹽析:當鹽擇濃度窗升高線到一夢定程熄度后械，蛋遙白質(zhì)夏的溶獄解度匠又隨朝著鹽粘濃度華的升菜高而賊降低漫，結(jié)邁果使延蛋白統(tǒng)質(zhì)沉戲淀析譽出，遭這種炮現(xiàn)象蛾稱為鹽析;同一戶濃度蓬鹽溶燥液中拔，不榴同蛋哪白質(zhì)扯的溶工解度平不同覆，借壘此可坐達到毫彼此借分離嘴的目紐奉的。鹽溶借原理:蛋白廉質(zhì)吸寄附某枕種鹽持離子掘后彼噸此排喇斥。鹽析炕原理小：鹽祝濃度廚增高惕到一棵定數(shù)肢值后衫，水墻活性近降低防，水目化膜調(diào)相繼弱被破櫻壞，尚最終肚引起鞋蛋白霜質(zhì)分擺子間谷相互交聚積彎并從斤溶液臂中析丑出溫度映對蛋胡白質(zhì)兩溶解輔度的糖影響0-較40吹℃之間尚，大養(yǎng)部分哄球狀螞蛋白贏質(zhì)的辣溶解活度隨冒溫度悅的升孫高而奴增加啄。有機年溶劑費分級州分離毒法降低錄水溶政液的抬介電請常數(shù)效，破卡壞大碑分子床周圍可水膜到，使哪溶質(zhì)坡溶解供度降絞低;利用棍不同筍蛋白欄質(zhì)在調(diào)不同饅濃度尋的有湊機溶槳劑中買的溶扶解度糖不同骨而使矩蛋白剩質(zhì)分灰離的漲方法授，有裳機溶姥劑沉加淀法吼。經(jīng)露常使岡用的齡有機乓溶劑發(fā)是乙毀醇和框丙酮閑；易使證蛋白瞧質(zhì)和挖酶變掙性，憑操作死必須芽在低溫條件徐下進喊行。電泳:在外削電場悶的作叉用下請，帶餐電顆翅粒向夸著與志其電與性相撐反的喪電極街移動換，這眾種現(xiàn)紅象稱孝為電牌泳。原則膜上按袍電泳其的原飯理來燦分，種可分煎為：（三客）根牌據(jù)電展荷不面同的販純化趙方法自由灰界面彈電泳區(qū)帶棵電泳濾紙需電泳貫和薄摘膜電嫩泳（惕醋酸樂纖維牢素薄彈膜、逐聚酰遞胺薄沿膜）粉末尾電泳哥（淀患粉、描纖維類素粉杰、硅竹膠粉有，粉珍末與造適當縮慧溶劑攪調(diào)和頁，鋪質(zhì)板）細絲充電泳遣，如肆尼龍古絲和鬼其它或人造拔絲電逮泳，滅這是憲一類欠微量木電泳凝膠棒電泳蹈，最嗚常用婆的支帽持介捎質(zhì)是偏聚丙鍛烯酰館胺凝蠢膠和扮瓊脂垮糖凝修膠聚丙缺烯酰費胺凝波膠電夸泳(P學AG劃E)濃縮掏膠樣品分離羨膠在PA丟GE中，鑰除了凍一般甩的電過荷效凡應外舍，還敲有凝掘膠對木樣品喉的分輔子篩殲效應杯和濃營縮效愧應，班三托種效艇應共伍同起某作用蒜，遞使樣松品的抄分離泉效果聲大大脅提高額。Tr縮慧is高-G川ly表pH嶺=8顆.3Tr容is穿-G錫ly宮pH洲=8騎.3Tr驕is匯-H做Cl躍pH粥=6.芝8T=貧3%Tr焰is基-H距Cl責pH瓶=8團.9T=陡7.晌5%SD謊S-聚丙衛(wèi)烯酰劣胺凝真膠電島泳寬（SD候S-樣PA渴GE）0.泡5馬1.菊0kD33哀022晌067603618千.5kD9467433020助.114兄.4Mo其l籍ma心sskD30抖020賺010制080605040302010Mi鍬gr賞at沉io瓦n漠(Rf)Ph勸ar游ma炊ci羽a:吹M研ol忍ec洗ul榨ar詳M嚼ar島ke丸rs奇f吉or蒸e背le停ct鉗ro眼ph其or拜es姑isA埋st沸ab字le霉p它H斤gr逝ad欠ie滋nt奴i克s濫es飄ta均bl丹is娛he莫d墓in靠t歇he只g翠el暑a戲ft批er瓣a亂pp硬li憲ca慮ti型on統(tǒng)o位f煩an姥e悅le嚷ct豪ri逮c啊fi利el陽d.Pr益ot篩ei點n著so點lu裕ti幼on重i腿s棄ad侵de唇d兵an障d像el秘ec政tr飾ic喪f鹽ie窄ld紋i品s愈re極ap祖pl吹ie輪d.Af偉te顆r蜓st荒ai輪ni厘ng園,艦pr福ot免ei業(yè)ns河a茫re倆s墾ho記wn猛t遭o婦be主d馳is唐tr蘇ib舞ut考ed弄a都lo著ng謝p慌H潔gr匙ad攀ie骨nt連a緒cc衰or功di電ng蕉t癥o疊th跑ei合r蕩pI膜v錦al由ue嫁s.等電紹聚焦(I焦EF底)pH梯度漿制作享：利屑用兩沾性電被解質(zhì)(商品站名:愛Am岔ph發(fā)ol郵in井e)，多變氨基維多羧店酸系略列兩咳性化棄合物味同系枝物的葬復雜親混合礙物，惑它們殃有相鄰近但襪不同乳的pH和pI值，浸在電壤場作帽用下慨，自錄然形惡成pH梯度.電泳姜就是而在凝語膠中環(huán)加入模兩性銳電解間質(zhì)從龜而構(gòu)腳成從返正極光到負棉極pH逐漸積增加仿的pH梯度冶，處季在其擠中的憐蛋白景分子和在電動場的初作用獨下運率動，備最后套各自迅停留乓在其庫等電絕點的遇位置吐上，作測出雖蛋白肯分子龜聚焦罰位置隸的pH值，卻便可插以得遇到它織的等摧電點慨。Fi葵rs砍t然di擠me外ns獎io干nIs紹oe核le括ct波ri脹c怨fo原cu仁si飽ngIs碑oe爹le鎖ct以ri婦c危fo源cu變si藍ng浮g它el稱i磁s遷pl由ac擋ed磁o紛n脹SD托Spo見ly嚼ac灣ry煉la享mi味de身g手el拍.Se虹co線nd含d鋪im恢en朗si鼠onSD犧S-鳳po惰ly輕ac芝ry衣la渣mi崇dege補l原el感ec缺tr枯op施ho剝re憲si愛s雙向倍電泳(T曾wo哥-d糊im匯en踏si延on睬al曠e辯le夜ct滿ro紹ph滲or盞es董is掉)此法增是利德用離診子交窩換樹館脂作慘為柱錘層析揀支持否物，弄將帶努有不戒同電渠荷的照蛋白貢質(zhì)進皇行分釋離的絲式方法秀。若選超擇陽受離子夾交換多樹脂青，則澆帶正出電荷等的物加質(zhì)與H+發(fā)生基交換竟而結(jié)寫合在萍樹脂菠上。若選心擇陰遲離子鵲交換肌樹脂縮慧，則魔帶負壘電荷唇的物串質(zhì)可壇與OH-發(fā)生命交換羨而結(jié)盞合在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