定量CR方法及數(shù)據(jù)

定量PCR原理、應(yīng)用及數(shù)據(jù)分析ZJW原理：PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。反應(yīng)分為變性（denaturation）、退火（annealing）、延伸（extension）三步。PCR擴(kuò)增理論方程：起點(diǎn)定量與終點(diǎn)定量：起點(diǎn)的DNA量為“天然”的含量，更有意義；終點(diǎn)的DNA量為經(jīng)過PCR過程“加工”的量，存在部分“失真”。（終點(diǎn)定量存在更大的誤差）定量PCR：通過實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板進(jìn)行定量或者定性的分析化學(xué)原理：熒光染料嵌合法,探針法SYBRGreenI（不飽和型），EvaGreen/LCGreen（飽和型），與dsDNA小溝部位嵌合，具有綠色激發(fā)波長。游離時(shí)不發(fā)光。缺點(diǎn)：需用meltingcurve檢測產(chǎn)物特異性。探針法：可用于多重PCR及基因分型

TaqMan探針：檢測積累熒光

一種寡核苷酸探針,探針兩端各錨定一個(gè)基團(tuán)，淬滅劑則在3‘末端。

Taqman探針識(shí)別并結(jié)合特定的靶序列；探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)R發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)Q吸收；在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí),Taq聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷,使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離,發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號(hào)的產(chǎn)生。基線：擴(kuò)增曲線中的水平部分閾值（Threshold):指擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢測界限。Ct值：從基數(shù)到指數(shù)增長的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)定量PCR數(shù)學(xué)原理定量PCR技術(shù)的應(yīng)用定性分析：病毒病原菌檢測、生物品種鑒定、SNP分析等、基因突變分析等絕對(duì)定量：基因拷貝數(shù)分析，病毒病原菌定量分析等相對(duì)定量：mRNA表達(dá)分析，siRNA表達(dá)分析等定量PCR實(shí)驗(yàn)流程目標(biāo)基因的查找、比對(duì)引物、探針的設(shè)計(jì)與合成反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化數(shù)據(jù)分析定量PCR引物設(shè)計(jì)的要求：①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300bp之間都可。④引物的退火溫度要高，一般要在60℃以上。內(nèi)參基因的選擇：內(nèi)參：用于去除不同樣本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率差異對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的影響。穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的組織和細(xì)胞中（如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞），而且其表達(dá)量無顯著差異；高度或中度表達(dá)，排除太高或太低表達(dá)；表達(dá)水平與細(xì)胞周期、細(xì)胞是否活化無關(guān)，且不受任何外源性和內(nèi)源性因素的影響。常見幾種內(nèi)參基因的優(yōu)缺點(diǎn)：GAPDH：在不同癌組織（包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌）中表達(dá)升高，在不同個(gè)體間、妊娠期間以及細(xì)胞周期的不同階段，以及多種因素刺激下（包括低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等）表達(dá)存在差異；β-actin：細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化時(shí)表達(dá)水平增加；18SrRNA:rRNA合成的調(diào)節(jié)獨(dú)立于mRNA。rRNA不包括PolyA尾，在以O(shè)ligodT作為引物的cDNA合成中不能被轉(zhuǎn)錄。rRNA高豐度表達(dá)，遠(yuǎn)高于目標(biāo)基因，較其他內(nèi)參基因穩(wěn)定，且受RNA降解的影響比較小。反應(yīng)體系的配制

（25ul體系）組分加量模板cDNA2uL10uM引物F/R各0.5uL2xSYBRGreenmix12.5uLddH2O9.5uL熔解馳曲線絕對(duì)偷定量扇：從熒盒光強(qiáng)楚度到檔拷貝盞數(shù)相對(duì)踢定量平的數(shù)父據(jù)分裳析(2-ΔΔCt法/c鉆om禮pa門ra游ti雞ve亡C態(tài)t蕉me澡th氏od揉)Li眠va挎k,忍K州.谷J冷et尾a像l.耀"勒An飼al哪ys羅is旱o銷f持re因la映ti得ve鳥g航en逢e軟ex趁pr陰es疲si旨o(jì)n膀d藝at群a繡us幼in逐g酷re冰al況-t們im辨e駝qu哄an骨ti絕ta發(fā)ti泥ve渴P舞CR它a鴨nd包t謠he囑2諷(-民De宋lt盾a摩De仔l(wèi)t恰a蹈C(愛T)訓(xùn))稈Me概th們od丸."目標(biāo)乒基因析表達(dá)吊量（艙處理贊組/非處盛理組借）的蔽差異Li軍va執(zhí)k,篇K丹.用J紛et編a數(shù)l.差"斗An蔽al國ys積is被o號(hào)f廚re辰la味ti內(nèi)ve糕g惱en詳e朵ex拴pr粱es銷si詳on圈d喇a(chǎn)t選a范us妖in山g新re捷al傘-t罰im核e索qu暮an緞ti偶ta備ti需ve希P敏CR雨a撕nd年t菜he擦2蟲(-堅(jiān)De專lt挪a揭De橫lt疤a吊C(沒T)愈)邪Me饑th切od得."Li負(fù)va短k,騾K斥.焦J傘et亮a健l.螞"虹An缺al匠ys航is渣o案f出re小la果ti催ve誤g烏en圾e靜ex太pr顯es練si平on濤d舒at嚇a燃us灘in兵g況re賢al欲-t鴨im角e繭qu濱an莊ti笛ta館ti糠ve罰P汪CR捉a渣nd肥t泳he毯2鐘(-艦De摟lt襪a丹De滿lt歌a倘C(昏T)匆)酬Me踐th杯od倆."Li體va璃k,效K葉.冷J部et強(qiáng)a妨l.殼"剃An蕉al躍ys灑is郊o(jì)香f旺re義la鋼ti各ve喪g可en瓣e斷ex研pr態(tài)es蔽si袖on娃d秩at濤a煤us懂in硬g睛re獸al儀-t棕im現(xiàn)