VCC1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及肝癌細(xì)胞SMMC7721穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的建立及鑒定

VCC1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及肝癌細(xì)胞SMMC7721穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的建立及鑒定VCC1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及肝癌細(xì)胞SMMC7721穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的建立及鑒定

：牟霞,陳瑤,王穗海,黃湘,李明

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VCC1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及肝癌細(xì)胞SMMC7721穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的建立及鑒定

態(tài),在氨芐青霉素抗性平板上篩選生長(zhǎng),挑取單克隆菌落。陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切鑒定,并命名為:pMD19T/VCC1。

1.2.5真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/VCC1的構(gòu)建用BamHI、XhoI分別雙酶切重組pMD19T/VCC1質(zhì)粒及pcDNA3.1(-)空載體,凝膠電泳后回收目的片段,16℃連接10h。連接、轉(zhuǎn)化,方法同前。陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切鑒定后測(cè)序(Invitrogen公司)。測(cè)序正確后擴(kuò)大培育,抽提重組質(zhì)粒DNA。

1.2.6細(xì)胞培育SMMC7721細(xì)胞在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培育液中,于37℃、50mL/LCO2飽和濕度的孵箱中培育。

1.2.7SMMC7721細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染和篩選培育將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC7721細(xì)胞以4×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中,培育24h,使細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合。用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)空質(zhì)粒及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1h先予細(xì)胞更換無(wú)血清培育基,使細(xì)胞適應(yīng)條件變更。并預(yù)備以下2種溶液,A液:4μg質(zhì)粒DNA溶于150μL無(wú)血清培育液中;B液:4μL脂質(zhì)體溶于150μL無(wú)血清培育液中。將A液與B液混勻,室溫孵育30min,以形成DNA脂質(zhì)體復(fù)合體,加入培育液中。培育8～14h,更換為完全培育液,連續(xù)培育24h,次日于完全培育液中加入800mg/L的G418連續(xù)進(jìn)行培育,2周后G418濃度改為400mg/L維持篩選。用選擇培育液培育4周后,分別陽(yáng)性克隆并擴(kuò)大培育備用。

1.2.8轉(zhuǎn)染后VCC1表達(dá)的鑒定分別以βactin和GADPH為內(nèi)參照,對(duì)VCC1基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)目的基因的mRNA及蛋白表達(dá)狀況進(jìn)行鑒定。分別收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體重組質(zhì)粒的細(xì)胞,樣品處理后進(jìn)行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、TBST緩沖液洗膜、50g/L脫脂牛奶封閉。一抗為VCC1小鼠多抗,二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG,ECL顯色。

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結(jié)果

2.1總RNA提取用一步法勝利提取SMMC7721總RNA,總RNA電泳結(jié)果可見(jiàn)有5S、18S和28S3條帶。

2.2RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定及真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定SMMC7721總RNA經(jīng)RTPCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果可見(jiàn)在約360bp處有一特異性擴(kuò)增條帶(圖2),與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符。將用BamHI、XhoI雙酶切重組質(zhì)粒pMD18T/VCC1得到的目的基因插入pcDNA3.1(-)空質(zhì)粒,獲得pcDNA3.1(-)/VCC1真核表達(dá)質(zhì)粒,該質(zhì)粒再經(jīng)BamHI、XhoI雙酶切鑒定,得到了360bp的目的片段和約5400bp的載體片段（圖1）,送測(cè)序證明該質(zhì)粒含有完全正確的VCC1cDNA序列。

圖1RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/VCC1雙酶切鑒定（略）

M:DL2000DNAmarker;1:pcDNA3.1(-);2:pcDNA3.1(-)/VCC1;3:VCC1RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

2.3穩(wěn)定表達(dá)株的篩選與鑒定將pcDNA3.1(-)/VCC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞系SMMC7721,經(jīng)4周選擇性培育（400mg/LG418）后,得到了穩(wěn)定表達(dá)目的基因mRNA的陽(yáng)性細(xì)胞株。篩選后的VCC1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞經(jīng)RTPCR及Westernblot方法分析,轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(-)/VCC1的SMMC7721細(xì)胞與對(duì)比轉(zhuǎn)染空載體及未轉(zhuǎn)染的SMMC7721細(xì)胞相比,三者的內(nèi)參表達(dá)水平差別不大,轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(-)/VCC1的SMMC7721細(xì)胞擴(kuò)增后的VCC1目的條帶明顯比對(duì)比轉(zhuǎn)染空載體的亮,說(shuō)明重組子已勝利轉(zhuǎn)入SMMC7721細(xì)胞并得到表達(dá),而且轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(-)/VCC1或空pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的SMMC7721細(xì)胞擴(kuò)增后均得到1條大小為492bp的條帶(PGKneo),而未轉(zhuǎn)染的SMMC7721細(xì)胞沒(méi)有擴(kuò)增出該

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條帶,說(shuō)明VCC1已轉(zhuǎn)入到SMMC7721細(xì)胞中(圖2、3)。

圖2各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞VCC1基因的mRNA水平變化（略）

M:DNAmarker;1,2:空白未轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞組;3,4:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)空載體組;5,6:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/VCC1組.

圖3各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞VCC1基因蛋白水平變化（略）

M:蛋白marker;1:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/VCC1組;2:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)空載體組;3:空白未轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞組.

3爭(zhēng)論

大量討論表明［2-4］,VEGF及趨化因子與腫瘤的血管發(fā)生、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遷移、凋亡等有親密聯(lián)系。VCC1作為一個(gè)與VEGF相關(guān)的蛋白,結(jié)構(gòu)與CXC類趨化因子相像,討論顯示其在血管形成中扮演了重要角色,而且可能在一些組織的腫瘤發(fā)生及免疫調(diào)整中具有重要作用［5］。為進(jìn)一步討論VCC1過(guò)表達(dá)后對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響,在本試驗(yàn)中我們將此基因構(gòu)建在真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(-),經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定、測(cè)序證明目的基因VCC1序列正確,勝利構(gòu)建重組子pcDNA/VCC1。然后將所構(gòu)建的含VCC1基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SMMC7721細(xì)胞,并用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,選擇抗性克隆,將新的克隆細(xì)胞選擇出擴(kuò)大培育。由于VCC1基因是一個(gè)在腫瘤廣泛表達(dá)的基因,SMMC7721細(xì)胞中也有表達(dá),因此為了鑒定VCC1基因是否已經(jīng)轉(zhuǎn)染到SMMC7721細(xì)胞中,我們可以通過(guò)擴(kuò)增G418抗性基因PGKneo序列來(lái)鑒定,由于pcDNA3.1(-)中帶有G418抗性基因PGKneo,該序列是很特異的,人的SMMC7721細(xì)胞中不含有該序列,假如沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,那么就擴(kuò)增不出492bp的特異條帶。而且轉(zhuǎn)染了VCC1基因的SMMC7721細(xì)胞,其VCC1目的條帶比轉(zhuǎn)染了

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［2］BrandS,DambacherJ,BeigelF,etal.CXCR4andCXCL12areinverselyexpressedincolorectalcancercellsandmodμlatecancercellmigration,invasionandMMP9activation［J］.ExperimentalCellResearch,2024,310(1):117-130.

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［4］王宏光,李開(kāi)宗,竇科峰,等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2024,17（4）:359-361.

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