【精品課件】5.3血紅蛋白的提取和分離

萬曉軍生物工作室1課題3

血紅蛋白的提取和分離

萬曉軍生物工作室2一、基礎(chǔ)知識：（一）蛋白質(zhì)提取和分離原理

（二）蛋白質(zhì)提取和分離的方法

1）凝膠色譜法：又稱分配色譜法

2）電泳法（三）緩沖液的作用萬曉軍生物工作室3二、實驗操作－－實驗步驟樣品處理和粗分離純化純度鑒定

血液組成成分

1.洗滌紅細胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白萬曉軍生物工作室4二、實驗操作－－實驗步驟

血液組成成分

1.洗滌紅細胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白樣品處理和粗分離純化純度鑒定萬曉軍生物工作室5蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)－－蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)差異：

1.分子的形狀、大小

2.電荷性質(zhì)和多少

3.溶解度

4.吸附性質(zhì)

5.對其他分子親和力

萬曉軍生物工作室61.凝膠色譜法

（1）原理：（2）材料：凝膠大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。凝膠是微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。內(nèi)部有許多貫穿的通道.根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法概念：萬曉軍生物工作室7洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動?；旌衔锷现疵摯蠓肿恿鲃涌煨》肿恿鲃勇占蠓肿邮占》肿?/p>

萬曉軍生物工作室82．凝膠電泳法：1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。2）影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素電泳：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程思考：蛋白質(zhì)為什么帶有電荷？在一定的PH下，蛋白質(zhì)可解離的基團會帶上電荷萬曉軍生物工作室92．凝膠電泳法：1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。2）影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素電泳：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程思考：蛋白質(zhì)為什么帶有電荷？萬曉軍生物工作室103）常用電泳方法

瓊脂糖凝膠電泳聚丙酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

加入帶負電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。

萬曉軍生物工作室11影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素

決定運動方向電場作用力形成阻力決定運動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√萬曉軍生物工作室12由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等（4）緩沖溶液－－洗脫劑

作用：

配制：調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。

思考：如何配制不同PH值不同的緩沖液？萬曉軍生物工作室13血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細胞中________細胞數(shù)量最多，細胞的含量最高的化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的______________________基團。血漿血細胞紅細胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素萬曉軍生物工作室141.洗滌紅細胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌的方法是什么？洗滌干凈的標志是什么？血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水攪拌10min重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色萬曉軍生物工作室152.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：蒸餾水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分攪拌的目的是____________________________。使紅細胞大量吸水脹裂溶解紅細胞的細胞膜加速紅細胞的破裂萬曉軍生物工作室16濾紙過濾脂類物質(zhì)3.分離血紅蛋白分離過程紅細胞混合液高速離心10min離心管燒杯有機溶劑血紅蛋白萬曉軍生物工作室1720mmol/L磷酸緩沖液4.透析血紅蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)萬曉軍生物工作室18純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫萬曉軍生物工作室19步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-7520mmol/L磷酸緩沖液“G”表示什么？75代表什么？萬曉軍生物工作室20注意：色譜柱不能內(nèi)不能有氣泡；裝完后，立即用緩沖液洗滌，平衡凝膠是凝膠裝填緊密萬曉軍生物工作室213.樣品的加入和洗脫

1.調(diào)液面2.加樣3.再調(diào)液面

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠萬曉軍生物工作室22注意事項1.紅細胞的洗滌：

洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2.色譜柱的裝填：

裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。3.凝膠的預處理：

沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡4.色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。Why？萬曉軍生物工作室23知識總結(jié)血紅蛋白的提取和分離