成信工環(huán)境工程微生物學實驗指導04土壤（水）中細菌的接種和培養(yǎng)技術(shù)

PAGE22PAGE21PAGE1實驗四土壤（水）中細菌的接種和培養(yǎng)技術(shù)一、實驗目的1、學習并掌握水樣的采取方法；2、掌握倒平板的方法；3、掌握微生物的稀釋涂平板接種技術(shù)；4、掌握微生物的培養(yǎng)技術(shù)二、實驗原理在土壤、活性污泥及生物膜等構(gòu)筑物中，微生物都是以群體形式混雜在一起的，要了解其微生物間的相互關(guān)系、降解機理及優(yōu)勢類群，需要進行純接種技術(shù)和培養(yǎng)技術(shù)。純接種技術(shù)工作對污染控制也具有特別重要的意義。將從自然環(huán)境中分離到的有著特殊降解能力的高效菌種投放到處理系統(tǒng)中，可強化系統(tǒng)處理能力，提高其處理效果。要想得到某微生物的純種，通常是根據(jù)其對營養(yǎng)、溫度、pH值、溶解氧等條件的要求選擇不同的培養(yǎng)基（如培養(yǎng)霉菌用查氏培養(yǎng)基或馬鈴薯培養(yǎng)基；酵母菌用麥芽汁培養(yǎng)基；放線菌用高氏1號培養(yǎng)基；腐生細菌用牛肉瓊脂培養(yǎng)基等），在一定的條件下進行培養(yǎng)，在用劃線分離法或稀釋分離法分離、純化，直至得到純菌體。三、實驗儀器、材料（一）無菌培養(yǎng)皿（直徑90mm）10套、無菌移液管lmL2支、10mLl支。（二）營養(yǎng)完全培養(yǎng)基1瓶、活性污泥或土壤或湖水1瓶、無菌稀釋水90mLl瓶、9mL的5管。（三）接種環(huán)、酒精燈或煤氣燈、恒溫箱。四、實驗內(nèi)容1．取樣用無菌錐形瓶到現(xiàn)場取一定量的湖水或土壤或活性污泥，迅速帶回實驗室。2．稀釋水樣將1瓶90mL和5管9mL的無菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次編號。在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL水樣圖16樣品稀釋過程（或其他樣品10g）置于第一瓶90mL無菌水（內(nèi)含玻璃珠）中，將移液管吹洗三次，用手搖10min將顆粒狀樣品打散，即為10-1濃度的菌液。用1mL無菌移液管吸取1mL10-1濃度的菌液于一管9mL無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為10-2濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10-6。稀釋過程如圖16。3．平板的制作取10套無菌培養(yǎng)皿編號，10-4、10-5、10-6各3個（三個平行樣品），另1個為空氣對照。取1支1mL無菌移液管從濃度小的10-6菌液開始，以10-6、10-5、10-4為序分別吸取0.5mL菌液于相應編號的培養(yǎng)皿內(nèi)（注意：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻，吹吸時不能產(chǎn)生氣泡）。加熱融化培養(yǎng)基，當培養(yǎng)基冷至45℃左右時，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時針和逆時針來回轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板。4.培養(yǎng)技術(shù)條件將稀釋涂布好的平板倒置，于恒溫養(yǎng)箱中，30-35℃培養(yǎng)24~48h，然后觀察結(jié)果。（注：若在無菌室內(nèi)操作，倒平板按圖17操作）。圖17倒平板圖18接種環(huán)及其他器具取“對照”的無菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋l0min后蓋上皿蓋，倒置于30℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。五、幾種接種技術(shù)操作由于實驗的目的、所研究的微生物種類、所用的培養(yǎng)基及容器的不同，因此，接種方法也有多種，現(xiàn)簡介如下：（一）接種用具常用的接種用具有接種環(huán)、接種針、接種鉤、玻璃刮刀、鏟、移液管、滴管等。接種環(huán)和接種針等總長約25cm，環(huán)、針、鉤的長為4.5cm，可用鉑、電爐絲或鎳絲制成。上述材料以鉑金絲最為理想，其優(yōu)點是：在火焰上灼燒紅得快，離火焰后冷得快，不易氧化且無毒。但價格昂貴，一般用電爐絲和鎳絲。接種環(huán)的柄為金屬的，其后端套上絕熱材料套。柄也可用玻璃捧制作。（二）接種環(huán)微生物的分離培養(yǎng)、接種等操作需在經(jīng)紫外線燈滅菌的無菌操作室、無菌操作箱或生物超凈臺等環(huán)境下進行。教學實驗由于人多，無菌室小，無法一次容納所有實驗者。所以，在一般實驗室內(nèi)進行時要特別注意無菌操作。也可多組分批進行。（三）稀釋平板涂布法稀釋平板涂布法與稀釋平板法、平板劃線法的作用一樣，都是把聚集在一起的群體分散成能在培養(yǎng)基上長成單個菌落的分離方法。此法接種量不宜太多，只能在0.5mL以下，培養(yǎng)時起初不能倒置，先正擺一段時間等水分蒸發(fā)后倒置。此法步驟如下：（1）稀釋樣品：方法與稀釋平板法中的稀釋方法和步驟一樣。（2）倒平板：將融化的并冷至45℃左右的培養(yǎng)基倒入菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板。（3）用無菌移液管吸取一定量的經(jīng)適當稀釋的樣品液于平板上，換上無菌玻璃刮刀在平板上旋轉(zhuǎn)涂布均勻。（4）正擺在所需溫度的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，如果培養(yǎng)時間較長，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)。（5）待長出菌落觀察結(jié)果。六、實驗報告內(nèi)容1、稀釋接種技術(shù)的布驟（示圖法表示）、注意事項。2、簡述稀釋的倍數(shù)和培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等）。思考