六味地黃丸對(duì)自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞增效作用的量效關(guān)系

六味地黃丸對(duì)自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞增效作用的量效關(guān)系【摘要】【目的】觀測(cè)六味地黃丸含藥血清對(duì)自殺基因HSVtk/GCV系統(tǒng)殺傷大鼠肝癌CBRH7919細(xì)胞的增效作用，探討建立自殺基因聯(lián)合中藥方藥的腫瘤基因治療聯(lián)合方案的可行性?！痉椒ā繕?gòu)建HSVtk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)，并確定丙氧鳥(niǎo)苷的工作濃度;制備SD大鼠4d和8d六味地黃丸灌胃含藥血清和生理鹽水灌胃空白血清；用大鼠肝癌細(xì)胞CBRH7919/tk-或tk+與tk-1∶9比例混合細(xì)胞按3×103個(gè)/孔鋪96孔板，分為空白血清組、GCV加空白血清組、10%tk+/GCV加空白血清組、含藥血清組、GCV加含藥血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合含藥血清組；含藥血清又再分為低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組6個(gè)復(fù)孔，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，各組分別加入相應(yīng)空白血清或含藥血清，孵育12h，加入終濃度392μmol/L的GCV，培養(yǎng)60h，采用四甲基偶氮唑鹽法檢測(cè)細(xì)胞活性，Q值法分析自殺基因系統(tǒng)與含藥血清聯(lián)合的相互作用是否具有協(xié)同性?！窘Y(jié)果】空白血清組、含藥血清組、GCV加空白血清組、GCV加含藥血清組細(xì)胞均未顯示明顯的細(xì)胞毒性。10%tk+/GCV加空白血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合不同濃度的含藥血清組均具有顯著殺傷作用，聯(lián)合組存活率顯著低于10%tk+/GCV加空白血清組；含藥血清中劑量和高劑量組的聯(lián)合作用具有協(xié)同性，且有濃度依賴性。給藥4d血清和給藥8d血清結(jié)果無(wú)顯著性差異?！窘Y(jié)論】六味地黃丸含藥血清對(duì)自殺基因系統(tǒng)10%tk+/GCV殺傷大鼠肝癌CBRH7919細(xì)胞具有協(xié)同增效作用，且有一定的量效關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】六味地黃丸/藥理學(xué)；肝腫瘤/中西醫(yī)結(jié)合療法；基因治療；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)

自殺基因療法由于存在旁殺傷效應(yīng)的獨(dú)特機(jī)制已成為惡性腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)和最有應(yīng)用前景的腫瘤基因治療方法，目前已在臨床病人及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中廣泛用于惡性腫瘤試驗(yàn)性治療，并已觀察到較好的效果［1-4］。但體內(nèi)自殺基因治療仍存在載體轉(zhuǎn)染效率低、靶向性不夠、治療載體的毒副作用等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用。進(jìn)一步提高療效和減少毒副作用是研究熱點(diǎn)之一，聯(lián)合治療則能在一定程度上達(dá)到上述目的［5］。中醫(yī)藥是一個(gè)偉大寶庫(kù)，許多中藥方藥具有肯定的藥理效應(yīng)［6-8］，聯(lián)合中醫(yī)藥也可能是一種可行的方案。我們已有的初步研究結(jié)果表明［9-10］，自殺基因治療聯(lián)合補(bǔ)腎方藥六味地黃丸在體內(nèi)和體外均能起到協(xié)同增效的作用。本研究擬在細(xì)胞水平上對(duì)其量效關(guān)系作進(jìn)一步地論證，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料和方法

11主要試劑與儀器RPMI1640為Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清為T(mén)BD公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽、丙氧鳥(niǎo)苷、二甲基亞砜均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、凍存管、濾膜等均為美國(guó)Corning公司或丹麥MUNC公司產(chǎn)品；BNA3210型CO2培養(yǎng)箱；5WCJ1F超凈工作臺(tái)；3K18型高速冷凍離心機(jī);3169型倒置顯微鏡；ALG1104型電子天平；CDBERSCAN510型pH儀；NEXPOWER1000型純水器等。

12細(xì)胞株病毒包裝細(xì)胞PT67購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，已于前期將重組pLXSNtk質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PT67細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建了重組病毒包裝細(xì)胞，記為PT67tk［11］。大鼠肝癌CBRH7919細(xì)胞購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)。前期已用PT67/tk的含病毒上清培養(yǎng)液感染大鼠肝癌CBRH7919細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定整合、表達(dá)tk基因的重組大鼠肝癌CBRH7919/tk+細(xì)胞［12］。

13實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，體質(zhì)量180~230g，雄性，健康，清潔級(jí)［動(dòng)物合格證號(hào)SCXK2003~0001，粵監(jiān)證字2006A014；環(huán)境合格證號(hào)NO0010470］，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

14GCV殺傷敏感性及GCV工作濃度的確定［10］大鼠肝癌細(xì)胞CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+鋪96孔培養(yǎng)板；在鋪板24h后加入梯度濃度GCV，MTT法測(cè)定細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性，確定GCV的工作濃度為392μmol/L。

15六味地黃丸含藥血清和空白血清的制備及血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響［10］16只SD大鼠隨機(jī)分為2組，空白血清組灌胃生理鹽水，六味地黃丸含藥血清組灌胃六味地黃丸，制備4d和8d血清，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ^測(cè)空白血清和含藥血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明血清能在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞增殖，但當(dāng)血清濃度高于體積分?jǐn)?shù)20%時(shí)細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化，故實(shí)驗(yàn)時(shí)采用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小的體積分?jǐn)?shù)10%以下的血清濃度。

16自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)將大鼠肝癌細(xì)胞CBRH7919/tk+和CBRH7919/tk-按1∶9的細(xì)胞數(shù)混合，作為自殺基因tk/GCV系統(tǒng)作用的細(xì)胞；沒(méi)有自殺基因系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)組，其作用細(xì)胞均為tk-細(xì)胞，按3×103個(gè)/孔鋪96孔板，分為空白血清組、GCV加空白血清組、10%tk+/GCV加空白血清組、含藥血清組、GCV加含藥血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合含藥血清組；灌胃8d含藥血清又再分為低劑量組、中劑量組和高劑量組，共設(shè)12組，每組6個(gè)復(fù)孔；灌胃4d含藥血清則分為低劑量組和高劑量組，共設(shè)9組，每組6個(gè)復(fù)孔；血清濃度均為體積分?jǐn)?shù)。用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，加入相應(yīng)空白血清和含藥血清，孵育12h，再加入終濃度392μmol/L的GCV，培養(yǎng)60h后，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。

17統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和協(xié)同性分析采用SPSS115統(tǒng)計(jì)軟件，多組間兩兩比較用OneWayANOVA,LSD法。協(xié)同性分析用金正均Q值法判斷［13］，Q=實(shí)驗(yàn)聯(lián)合藥效R’/理論聯(lián)合藥效R，理論聯(lián)合藥效R=RA+RB-RA×RB，RA、RB為單獨(dú)用藥藥效。Q＜085則判斷為拮抗作用；085≤Q＜115則判斷為相加作用；Q≥115則判斷為協(xié)同作用。

2結(jié)果

21自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)空白血清組、含藥血清組、GCV加空白血清組、GCV加含藥血清組細(xì)胞均未顯示明顯的細(xì)胞毒性，表明在實(shí)驗(yàn)條件下血清和GCV對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。自殺基因系統(tǒng)10%tk+/GCV加空白血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合不同濃度的含藥血清組均具有顯著殺傷作用，表明自殺基因系統(tǒng)具有生物學(xué)功能；10%tk+/GCV系統(tǒng)聯(lián)合5%、10%含藥血清組的細(xì)胞存活率均顯著低于10%tk+/GCV加空白血清組及相對(duì)應(yīng)的含藥血清組，聯(lián)合組的實(shí)際抑制率均顯著高于理論抑制率，Q值分別為116、149，均大于115，說(shuō)明其相互作用具有協(xié)同性，且隨著含藥血清濃度的增高Q值增大，協(xié)同作用增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表1。

22自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)10%tk+/GCV自殺基因治療系統(tǒng)聯(lián)合25%、5%、10%濃度的含藥血清，細(xì)胞存活率均顯著低于含藥血清組與10%tk+/GCV加空白血清組。聯(lián)合組的實(shí)際抑制率均顯著高于理論抑制率，Q值分別為086、120、142。但25%的含藥血清聯(lián)合組的Q值在085~115之間，為相加作用；而5%、10%濃度聯(lián)合組均Q＞115，說(shuō)明其增效作用具有協(xié)同性，且隨著含藥血清濃度的增高協(xié)同作用增加。結(jié)果見(jiàn)表2。表1自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)表2六味地黃丸含藥血清聯(lián)合10%tk+/GCV系統(tǒng)對(duì)CBRH7919作用的殺傷效應(yīng)

3討論

自殺基因治療之所以能成為惡性腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)和最有應(yīng)用前景的腫瘤基因治療方法，是由于自殺基因治療存在旁殺傷效應(yīng)的獨(dú)特機(jī)制。所謂旁殺傷效應(yīng)是指導(dǎo)入了自殺基因的腫瘤細(xì)胞加入前體藥物后，不僅自身被殺死，其鄰近未導(dǎo)入自殺基因的細(xì)胞也被殺死的現(xiàn)象［1-2］。旁殺傷效應(yīng)形成機(jī)制的假說(shuō)主要包括［14］：“縫隙連接”機(jī)制；免疫介導(dǎo)機(jī)制；“細(xì)胞凋亡”機(jī)制；介質(zhì)機(jī)制；抗腫瘤血管生成等。由于在整體水平基因轉(zhuǎn)染效率很低，同時(shí)病毒載體的使用也帶來(lái)了一定的毒副作用，故自殺基因療法存在旁殺傷效應(yīng)這一獨(dú)特的作用機(jī)制具有許多優(yōu)勢(shì)，如能減少對(duì)高轉(zhuǎn)染率的要求，減少載體過(guò)量引起的毒副作用等。但在目前的情況下，由于體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率較低等原因，使腫瘤自殺基因治療的效果仍不十分令人滿意。以增強(qiáng)旁殺傷效應(yīng)為目標(biāo)的聯(lián)合治療是目前腫瘤自殺基因治療的研究熱點(diǎn)之一。現(xiàn)有中藥方藥藥理作用的研究結(jié)果提示：中藥方藥有可能針對(duì)自殺基因旁殺傷效應(yīng)的機(jī)制，通過(guò)增強(qiáng)自殺基因旁殺傷效應(yīng)對(duì)腫瘤自殺基因療法產(chǎn)生協(xié)同作用。我們前期的動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)研究表明，自殺基因療法聯(lián)合滋陰補(bǔ)腎中藥名方六味地黃丸能更有效地抑制小鼠移植性肝癌的生長(zhǎng)［9］。初步的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，自殺基因療法聯(lián)合滋陰補(bǔ)腎中藥名方六味地黃丸含藥血清在自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞時(shí)發(fā)揮協(xié)同作用［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在大鼠血清總濃度為10%的條件下，六味地黃丸灌胃4d的含藥血清在50%、10%含藥血清濃度下，與自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合作用的抑制率為2151%、2878%，較單純自殺基因系統(tǒng)的抑制率1449%分別提高了702%、1429%；六味地黃丸灌胃8d的含藥血清，在25%、50%、10%濃度下，與自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合作用的抑制率為2666%、3214%、3089%，較單純自殺基因系統(tǒng)的抑制率2193%分別提高了47%、102%、90%，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。結(jié)果表明六味地黃丸能增強(qiáng)自殺基因療法對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。我們還比較了4d含藥血清和8d含藥血清的增效作用效果，結(jié)果顯示無(wú)顯著性差異，提示灌胃4d含藥血清即可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

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