微波輔助萃取

微波輔助萃取【摘要】目的建立萃取和純化龍膽中龍膽苦苷的優(yōu)化參數(shù)。方法以龍膽苦苷含量和解吸率為指標，采用微波輔助萃取、大孔樹脂吸附純化和高效液相色譜法測定龍膽苦苷的含量。結(jié)果微波輔助萃取優(yōu)化條件：萃取劑60%乙醇，流速3ml·min-1；大孔樹脂分離富集優(yōu)化條件為：上樣速度ml·min-1，洗脫液50%乙醇，流速ml·min-1時分離純化效果好。結(jié)論在優(yōu)化的萃取、純化條件下制得這批龍膽原料龍膽苦苷平均含量為·g-1。

【關(guān)鍵詞】微波輔助萃取HPD-100大孔樹脂龍膽龍膽苦苷

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheoptimumparametersofextractionandpurificationofgentiopicrininGentianascabraBunge.MethodsMicrowave-assistedflowandmacroporousabsorptiveresinwereemployedrespectivelyintheextractionandpurificationprocesses.ThecontentofgentiopicrininthefractionswasevaluatedbyHPLC.ResultsTheappropriateextractionconditionswere:extractantconcentration60%ethanol,flowrate3ml·min-1.Whentheflowrateofsamplewasml·min-1,theeluantwas50%ethanolandflowratewasml·min-1,theeffectofseparationandpurificationwassatisfactory.ConclusionUndertheaboveoptimumconditionsthecontentofgentiopicrinwas·g-1fromthisbatchofGentianascabraBunge.

Keywords:Microwave-assistedflowextraction;HPD-1001macroporousresin;RadixGentianae;Gentiopicrin

龍膽GentianascabraBunge是一種常用中藥，有清濕熱、利肝膽的功效，龍膽中含有的主要成分為裂龍膽苦苷苷類苦味成分，如龍膽苦苷(gentiopicrin)、當(dāng)藥苦苷(swertiamarin)、當(dāng)藥苷(sweroside)等龍膽苦苷成分，研究表明龍膽苦苷為其主要活性成分，具有保肝、利膽、健胃、抗炎、抗菌等活性［1］，是評價龍膽質(zhì)量標準重要指標。微波輔助萃取(Microwaveassistedextraction,MAE)與傳統(tǒng)的索氏萃取方法比較，MAE能夠縮短萃取時間，減少能耗及溶劑用量，在大部分情況下能夠提高萃取產(chǎn)率。而大孔吸附樹脂具有良好的吸附性及一定選擇性，在中草藥有效成分的分離純化方面得到廣泛應(yīng)用［2］。

本文以龍膽中的主要成分龍膽苦苷含量為指標，結(jié)合MAE和大孔樹脂優(yōu)點，初步考察影響微波萃取和大孔樹脂分離富集龍膽中龍膽苦苷成分的參數(shù)。

1器材

龍膽采自麗水市郊大山峰，海拔1500m左右，經(jīng)李水福中藥師鑒定為龍膽GentianascabraBunge.，去梗，60℃恒溫烘干，粉碎，過40目銅篩得試樣；龍膽苦苷對照品；HPD-100大孔樹脂；Agilent1100高效液相色譜儀，20μl定量進樣環(huán)；流動微波提取裝置：將WD800TL23-K3型格蘭仕微波爐進行改造，在微波爐側(cè)面開兩個間距9cm、直徑為cm孔；乙醇(分析純)，甲醇(色譜純)。

2方法與結(jié)果

試樣中龍膽苦苷含量測定

AgilentZOBAXSB-C18(mm×150mm，5μm)色譜柱；檢測器DAD，參照文獻［3］選擇色譜條件為：檢測波長270nm；柱溫25℃；流動相：甲醇-%磷酸(10:90→60:40,0→30)；流速ml·min-1。準確稱取在P2O5干燥12h的對照品mg，用甲醇-%磷酸溶解并定容至10ml，混勻，分別吸取，，，，，ml于5ml容量瓶中，甲醇-%磷酸定容，每份平行測定3次，求峰面積均值，以峰面積均值A(chǔ)為縱坐標，龍膽苦苷質(zhì)量濃度X為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程：A=27463X+70451，r=4，線性范圍：～μg。在相同色譜條件下分析各試液，以外標曲線法計算各試液中龍膽苦苷含量。

微波協(xié)助萃取龍膽苦苷成分

乙醇濃度對萃取率的影響

準確稱取由四分法所得適量的試樣g，放入提取管，提取管上下用玻璃棉封好，放入改造后的微波爐內(nèi)進行微波提取，微波輸出功率為480W，占空比為40%。用蠕動泵以ml·min-1流速各次將10%，30%，50%，75%，95%濃度乙醇溶液30ml泵入提取管內(nèi)，開微波爐，收集萃取液，萃取完成后，關(guān)閉微波爐，繼續(xù)泵入5ml原乙醇溶液淋洗，淋洗液合并到萃取液中，經(jīng)旋蒸濃縮干燥后采用HPLC法測定龍膽苦苷含量，結(jié)果如圖1。從圖1看出，當(dāng)乙醇濃度50%與75%時萃取率最佳，結(jié)合經(jīng)濟成本，確定萃取液為60%乙醇。

萃取劑流速的影響

改變萃取劑流速，分別泵入60%的乙醇30ml，收集萃取液并用HPLC法測定，結(jié)果如圖2所示，隨萃取劑流速的增加，目標成分被萃取量先逐漸增加，當(dāng)流速3ml·min-1(即萃取時間為10min)時，萃取量達最大。

萃取劑體積的影響

稱取試樣g，選萃取劑流速ml·min-1，每次收集3ml萃取液，共15次，測定各份萃取液中龍膽苦苷含量，結(jié)果表明第1份到第4份萃取液中龍膽苦苷含量均高，第5份開始下降，到第9份、第10份時龍膽苦苷含量很低了，說明大部分目標成分在30ml內(nèi)萃取完成，因此確定萃取劑體積30ml，萃取劑體積與試樣質(zhì)量比值約為22∶1。

大孔吸附樹脂分離純化龍膽苦苷

大孔吸附樹脂動態(tài)吸附量的測定

經(jīng)大孔吸附樹脂預(yù)試驗，以HPD-100型大孔吸附樹脂對龍膽苦苷的吸附能力較好。取以上預(yù)處理好的樹脂4份各5g，濕法裝柱，按文獻［4］方法預(yù)處理好。取萃取優(yōu)化參數(shù)下所得提取液，減壓旋干，蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶并定容，每份含龍膽苦苷約110mg，上柱，上樣速度依次為，，，ml·min-1，按《中國藥典》2005年版Ⅰ部龍膽薄層鑒別方法檢測，與龍膽苦苷對照品比對，剛出現(xiàn)斑點即停止上樣，根據(jù)剩余試液量求得各流速下動態(tài)飽和吸附量依次為，，，16.31mg/g干樹脂，考慮時效因素，確定上樣速度ml·min-1。

洗脫液乙醇濃度的確定

按ml·min-1上樣速度處理大孔吸附樹脂柱5份，先飽和吸附，然后用蒸餾水洗脫至洗脫液還原糖反應(yīng)(Molish反應(yīng))為陰性，再分別用10%，30%，50%，75%，95%乙醇溶液以ml·min-1流速洗脫，薄層跟蹤檢測，收集洗脫液，按HPLC法測定各收集液中龍膽苦苷量，參照文獻［5］計算解吸率，結(jié)果如圖4。從圖4可知，由于10%，30%乙醇溶液極性較大，洗脫能力有限，不能使吸附在樹脂上的龍膽苦苷完全解吸，50%乙醇溶液則能使龍膽苦苷等快速解吸，故確定50%乙醇溶液為洗脫液。

洗脫液流速的影響

分別取10g預(yù)處理好的樹脂4份，濕法裝柱，以ml·min-1速度上樣，飽和吸附，以50%乙醇溶液在，，，ml·min-1流速下洗脫，薄層檢測，收集流出液，HPLC法測各收集液龍膽苦苷量，計算解吸率，結(jié)果如圖5。洗脫流速直接影響到洗脫液和樹脂的交換時間，流速太快，兩者接觸時間短，未能充分解吸而增加了洗脫劑用量，從而增加了操作成本和后續(xù)濃縮成本；流速慢，雖解吸效果好，但操作周期加長，增加了生產(chǎn)成本。圖5表明，洗脫流速～ml·min-1時洗脫效果好，考慮操作效率，選擇洗脫液流速ml·min-1。

驗證實驗按“”方法所得優(yōu)化萃取參數(shù)制備龍膽提取液3份，每份含龍膽苦苷100～110mg，分別上3個預(yù)處理好的大孔吸附樹脂柱，在優(yōu)化的分離純化條件下進行吸附與解吸，HPLC法測定收集液中龍膽苦苷量。結(jié)果表明HPD100大孔吸附樹脂平均動態(tài)吸附量為mg/g干樹脂，平均解吸率%，依此制得這批龍膽原料龍膽苦苷平均含量為mg·g-1。

3討論

微波協(xié)助萃取中萃取劑乙醇濃度是影響微波萃取效果最重要因素，它不僅影響試樣對微波的吸收，而且影響目標物的溶出，是提高萃取率和萃取選擇性的重要因素；其次，萃取劑流速也是較重要的因素，因為當(dāng)提取管體積一定時，流速越大，受微波輻射時間越短，就不能充分地與滲入試樣中的萃取溶液形成濃差擴散，另外適宜的流速也有利于降低成本。在分離純化龍膽苦苷過程中，上樣速度不能太快，以免上柱液中目標成分不能充分地被樹脂吸附而過早滲漏，不能形成動態(tài)飽和吸附平衡；要控制好洗脫液的極性，保持其適宜洗脫能力，既能把絕大部分目標成分解吸下來，又不能洗脫下過多的雜質(zhì)而影響產(chǎn)品純度。如果能把微波輔助萃取與大孔吸附樹脂分離純化偶聯(lián)起來，一定會有廣闊的應(yīng)用前景。

【參考文獻】

［1］徐國鈞.中國藥材學(xué)［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,1996：365.

［2］閆磊，何再安，劉焱文.大孔吸附樹脂在中藥研究中的應(yīng)用［J］.時珍國醫(yī)國藥,20