冰凍切片制作與染色過程中常見問題與處理

冰凍切片制作與染色過程中常見問題與處理1第一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五問題思考組織是否足夠新鮮？1w以內(nèi)？灌注固定液、洗液PH值、離子濃度是否合適？一抗是選擇途徑，滴度如何確定的？是否閱讀過DATASHEET?保存，有效期，reactivity,Cross-Reactivity？對該蛋白表達(dá)和分布有無預(yù)期的估計(jì)和了解?是否設(shè)了陽性和陰性對照？是否排除了自發(fā)熒光？是不是判讀正確？2第二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五一、冰凍切片的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：簡便，快速，用時短可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋組織變化不大能很好保存脂肪，類脂能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類對有機(jī)溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶保存較好。缺點(diǎn)：不容易做連續(xù)切片組織不能過大-不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均不容易制作較薄的切片凍結(jié)過程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位組織結(jié)構(gòu)不如石蠟切片清晰，但是滿足科研的要求針對其缺點(diǎn)要注意操作條件優(yōu)化，避免錯誤3第三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五二、切片制作過程中幾個關(guān)鍵步驟1.動物取材2.組織固定3.切片制作4.切片染色好的切片制作和染色成功的關(guān)鍵細(xì)節(jié)決定成敗固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗體效價、特異性；切片孵育時間，濕度、溫度；切片判讀正確-反映真實(shí)的科學(xué)現(xiàn)象知識結(jié)構(gòu)背景組織學(xué)結(jié)構(gòu)的熟悉……認(rèn)識病理改變：炎細(xì)胞侵潤、壞死、水腫、蛋白變性、纖維化、增生、凋亡……審美觀、拍照角度、視野、曝光時間、對比度……4第四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五常規(guī)HE染色特殊染色如：Masson(Thichromestaining)，油紅O，尼氏染色，臺盼藍(lán)（肥大細(xì)胞）染色免疫染色(immunolstaining)免疫熒光(immunolfluorescence)免疫組化(immunolhistochemistry)依據(jù)科學(xué)研究的需要選擇方法5第五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五1.動物取材：一定要注意“平行性”1Control6Control2Control3Control4Control5Control1sham6sham2sham3sham4sham5sham1I/R6I/R2I/R3I/R4I/R5I/R1I/R+treatment2I/R+treatment3I/R+treatment4I/R+treatment5I/R+treatment6I/R+treatment預(yù)實(shí)驗(yàn)時早發(fā)現(xiàn)趨勢而不被誤導(dǎo)，減少無效率的工作量減少不同組間baseline的影響，便于不同批次實(shí)驗(yàn)組間比較（背景，抗體效價，環(huán)境條件對染色影響）發(fā)表、修改文章圖的一致性橫向縱向橫向“block”6第六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五舉例：不同實(shí)驗(yàn)時間和條件下同種一染色方法結(jié)果差異ABCMassonstaining7第七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五2.標(biāo)本固定應(yīng)充分

固定的標(biāo)準(zhǔn)切片冰晶少，細(xì)胞擠壓變形小，切片完整，染色清晰一般較多采用組織固定后再行切片浸入法和灌注法浸入法：活檢、手術(shù)標(biāo)本，不能進(jìn)行灌注的組織固定灌注法：動物實(shí)驗(yàn)研究固定劑種類：醛類、非醛類、丙酮及醇類中性緩沖液配制多種聚甲醛較為常用組織固定時固定液要有足夠的量(固定液是組織體積的8-10倍)保持一定時間，快速灌注固定后，相同的固定劑再固定2-4h（4℃冰箱）8第八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五減少冰晶的形成

公認(rèn)：未經(jīng)固定的組織切片冰晶較多固定后的組織切片仍然會有一定的冰晶，為防止冰晶的形成采取如下方法速凍法：將組織置入低溫環(huán)境，使組織驟然降溫利用高滲溶液吸收組織水分子：將組織置于20%—30%的蔗糖溶液中，置4攝氏度冰箱足夠時間（多長時間?判定？）9第九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五3.切片：組織新鮮非陳舊標(biāo)本是成敗首要因素低溫恒冷箱冰凍切片法組織快速冷凍到一定的硬度(機(jī)器要預(yù)冷)選擇不同的冷凍度

根據(jù)不同的組織而定未經(jīng)固定的腦組織、肝組織：-10--15℃左右甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織：-15～20℃含脂肪組織，-25℃左右含大量的脂肪

-30℃10第十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五保持切片的完整性

切片破碎不全、有缺損的常見原因固定不完全溫度設(shè)置不當(dāng)組織塊過冷、過硬，則切片就容易破碎組織塊冷凍不夠，硬度和韌度達(dá)不到，切片也同樣易粘、易碎組織塊帶有皮膚、包膜、過大或冰晶過多切片刀鈍或較臟，切片出現(xiàn)刮痕，使切片不完整操作手法不當(dāng)，如速度不適宜11第十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五防止切片卷縮

常見原因切片刀鈍或粘有組織碎屑防卷板位置不正確或防卷板較臟靜電或者氣流作用防卷板溫度高、室溫高采取對策：保持防卷板干凈、平整、無缺損、無刮傷戴口罩，以避免呼出的氣流直接吹到防卷板切片時間過長時，應(yīng)注意間隔一會兒，蓋上冷凍室蓋，降低防卷板溫度12第十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五貼片中常見問題及處理

載玻片粘不上切片準(zhǔn)備的載玻片溫度過低將載玻片置于常溫即可貼片時切片易碎排除固定不充分等因素外貼片時應(yīng)注意動作輕、穩(wěn)、準(zhǔn)根據(jù)切片大小，選用筆尖軟硬適中、大小合適的毛筆根本的解決方法：多觀察，多練習(xí)，熟能生巧13第十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五貼片方式及標(biāo)記載玻片上標(biāo)記（鉛筆）組織類型時間組別檢測抗原類型同一載玻片上包括各個所有組染色齊性L1DRGCon.TNBSLYZD72882014.4.20TRPV1+CGRPTNBSCon.ZD7288LYL1DRGCon.TNBSLYZD72882014.4.20TRPV1+CGRPTNBSCon.ZD7288LYL1DRGCon.TNBSLYZD72882014.4.20TRPV1+CGRPTNBSCon.ZD7288LYL1DRGCon.TNBSLYZD72882014.4.20TRPV1+CGRPTNBSCon.ZD7288LY123414第十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五4.染色：抗體孵育和選擇:免疫組化最關(guān)鍵環(huán)節(jié)試劑公司提供標(biāo)準(zhǔn)化的試劑附詳細(xì)的試劑說明書（datasheet，特別強(qiáng)調(diào)?。┌贵w的來源免疫球蛋白的亞類單抗或多抗交叉反應(yīng)使用稀釋度使用流程和注意事項(xiàng)洗滌時緩沖液的適宜離子強(qiáng)度和PH值等15第十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五抗體分裝和保存購入的抗體分裝在多個安瓿中根據(jù)月需要量，大致每安瓿含5~20微升立即放置低溫冰箱內(nèi)貯存（-20℃以下）長期保存在4℃冰箱內(nèi)會失效避免反復(fù)凍融抗體效價急劇下降而失效16第十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五工作抗體的確定確定對于所要研究抗原的最敏感抗體已出版的文獻(xiàn)作為參考資料(IHC和WB抗體要注意區(qū)別)陽性切片進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)檢測抗體的最佳工作濃度了解哪些組織表達(dá)這些抗原有助于確定陽性染色，特別是當(dāng)細(xì)胞表達(dá)水平低時尤為重要17第十七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五三、免疫組化結(jié)果分析免疫組化結(jié)果的判斷原則：1.必須設(shè)對照2.抗原表達(dá)必須在特定部位3.陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)18第十八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五1.實(shí)驗(yàn)分析的相關(guān)介紹陽性對照：用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。對照切片呈陽性結(jié)果，標(biāo)為陽性對照。19第十九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對照陰性對照還應(yīng)包括空白對照：用PBS替代第一抗體替代對照：用與第一抗體來源的同一動物前血清，來替代第一抗體吸收實(shí)驗(yàn)：用過量的已知相應(yīng)的純化抗原與第一抗體反應(yīng)，抗體結(jié)合點(diǎn)全部與抗原結(jié)合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內(nèi)的抗原反應(yīng)抑制實(shí)驗(yàn)：待檢標(biāo)本先與未標(biāo)記的特異性抗體反應(yīng)后再與標(biāo)記的特異性抗體染色陰性對照：20第二十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五陽性對照陰性對照替代對照實(shí)驗(yàn)組結(jié)論1－－－－操作錯誤2＋＋＋＋非特異性反應(yīng)3＋＋－－陰性對照含定位Ag4－－－＋陰性對照不含定位Ag5＋－＋＋受檢組織非特異性染色6＋－－－受檢組織不含定位Ag7＋－－＋受檢組織含定位Ag2.免疫組化染色實(shí)驗(yàn)組與對照組結(jié)果分析表21第二十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五只有6，7實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義1～5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定Ab的特異性或因IHC技術(shù)操作存在錯誤等而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失去意義必須重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換用Ab陽性對照陰性對照替代對照實(shí)驗(yàn)組結(jié)論6＋－－－受檢組織不含定位Ag7＋－－＋受檢組織含定位Ag22第二十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五陽性染色特點(diǎn)定位：胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)有結(jié)構(gòu)性染色強(qiáng)度不同：顏色深淺不一非特異性染色細(xì)胞與組織無區(qū)別彌散性均勻3.綜合評價特異性陽性染色：23第二十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五

優(yōu)秀免疫組化切片:信噪比高ABC第二十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五假陽性示范圖*彌漫棕色或單一黃色的細(xì)胞染色可能是非特異性的25第二十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五4.染色失敗的幾種表現(xiàn)：(1)所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽性對照在內(nèi)。染色失敗(2)所有切片均呈陽性反應(yīng)(3)所有切片背景過深(4)陽性對照染色良好，檢測的

陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)26第二十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五(1)所有切片呈陰性1）染色未完全嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行

2）漏加一種抗體，或抗體失活3）緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉，抑制了酶的活性4）底物中所加H2O2

量少或失活5）復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)27第二十七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期五①切片在染色過程中抗體過濃，或干片了。緩沖液PH值不準(zhǔn)確，