分子生物學(xué)技術(shù)分子克隆

分子生物學(xué)技術(shù)分子克隆第一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五生物醫(yī)學(xué)研究常用基本技術(shù)分子克隆技術(shù)（DNA重組技術(shù)）免疫印跡技術(shù)（Westernblot）免疫組織化學(xué)技術(shù)（免疫組化）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)局限性聯(lián)合應(yīng)用第二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五分子克隆技術(shù)DNA體外重組技術(shù)：是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法將感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并篩選出表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、擴(kuò)增、成為克隆，這一過(guò)程稱為DNA體外重組技術(shù)。基本過(guò)程分、切、連、轉(zhuǎn)、篩第三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.分：分離出要克隆的目的基因及載體。①目的基因的來(lái)源：直接分離適于遺傳背景了解比較清楚的細(xì)菌染色體、質(zhì)粒及病毒DNA的提取分離。首先通過(guò)組建幾種限制性內(nèi)切酶的物理圖譜進(jìn)行基因定位，然后用DNA的酶切片段電泳分離DNA，應(yīng)用相應(yīng)DNA探針確定目的DNA后，從膠中回收DNA。(適合原核)人工合成序列明確的短DNA片段，可用DNA合成儀合成（適合較短的）。第四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五由mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA細(xì)胞總RNA分離mRNA分離目的基因mRNA的純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成cDNA的克隆從基因組文庫(kù)中篩選目的基因首先構(gòu)建基因組文庫(kù)（G文庫(kù)）或cDNA文庫(kù)（C文庫(kù)），需要時(shí)利用探針技術(shù)將所需目的基因“釣”出來(lái)。第五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五②載體：可容忍外源性DNA片段插入，可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移并能在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的DNA分子。理想的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)具有的特性：能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，并能攜帶DNA片段一同擴(kuò)增具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn),即多克隆位點(diǎn)(MCS,multiplecloningsites)，便于進(jìn)行克隆分子量小，可插入較大的外源DNA而不影響復(fù)制易于導(dǎo)入受體細(xì)胞具有容易操作的檢測(cè)表型。如抗生素抗性、α-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子，前導(dǎo)序列，增強(qiáng)子等調(diào)控元件生物安全性好目前常用的載體有質(zhì)粒、噬箘體、病毒等。第六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五載體第七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.切：用限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體，使其產(chǎn)生便于連接的末端。3.連：將切割后的目的基因和載體用T4DNA連接酶連接。4.轉(zhuǎn)：把連接好的重組載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞的過(guò)程（細(xì)菌：E.coli，真菌：Yeast，昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞）。5.篩：在不同層次上、不同水平上進(jìn)行篩選，鑒定所需的特異性重組子。使用各種方法，將帶有重組載體的宿主菌從培養(yǎng)基中篩選出來(lái)。例如：載體大小，酶切結(jié)果，篩選標(biāo)記等。第八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測(cè)序技術(shù)

DNA體外重組技術(shù)第九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五總RNA制備

Trizol法:主要用途：總RNA提?。―NA、蛋白質(zhì)提?。┲饕煞郑罕椒?、異硫氰酸胍等適用組織：人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織，細(xì)菌或真菌樣品量：從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA無(wú)蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。InvitrogenTRIzol?產(chǎn)品RNA提取試劑盒：國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口

常用總RNA提取試劑盒盡量選用含DNA酶的試劑盒第十頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五Trizol法提取總RNA步驟以50-100mg組織加入1mlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。

研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒，靜置3分鐘。

取上層水相于一新的離心管，按每1mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。

棄去上清液，按每1mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55℃-60℃水溶10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。

第十一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五Tips：樣品收集后迅速放入液氮；樣品在Trizol溶液中相對(duì)穩(wěn)定；注意避免RNase，尤其是內(nèi)源的；

豐度低的mRNA：實(shí)驗(yàn)所需的耗材需要0.1%DEPC水處理，高壓滅菌豐度中等以上的mRNA：耗材高壓滅菌即可。獲得高純度RNA，要懂得取舍；上清取適量即可（500ul）。

完全干燥的RNA溶解度極低；完全干燥的RNA呈透明狀；趁RNA沉淀仍然呈白色的時(shí)加水溶解RNA樣品相關(guān)實(shí)驗(yàn)要盡快進(jìn)行，如需保存RNA，需存于-80度超低溫冰箱；

第十二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五避免RNA酶污染由于RNA分子容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過(guò)程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中都要避免RNA酶污染。第十三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。實(shí)驗(yàn)用品用0.1%DEPC水處理（2h），高壓蒸汽滅菌后烤干備用或購(gòu)買經(jīng)過(guò)處理的無(wú)RNA酶實(shí)驗(yàn)用品。操作過(guò)程中帶手套、口罩。避免RNA酶污染第十四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（cDNA合成）逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）：是指在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過(guò)程。第十五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的基本成分模板:組織或培養(yǎng)細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶：AMV:禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒

M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒引物:oligodT,randomprimer，GSP等。RNA酶抑制劑底物：等濃度的四種dNTP反應(yīng)環(huán)境:緩沖液（RTbuffer）可單獨(dú)購(gòu)買或逆轉(zhuǎn)錄試劑盒第十六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五Tips：RNA質(zhì)量要好；無(wú)降解RNA樣品應(yīng)加熱變性處理；

RNA65oC處理5min，隨后迅速置于冰上，打開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)這一步不加任何反應(yīng)組分反應(yīng)中RNA模板量要合適；太多？太少？第十七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR技術(shù)PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。一種選擇性體外擴(kuò)增DNA的方法.一種將微量的目的DNA片段在體外快速、大量擴(kuò)增的技術(shù)。半保留復(fù)制KaryMullis1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)第十八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五三個(gè)基本步驟:(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈;(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì)(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)數(shù)百倍。

第十九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二十頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR反應(yīng)體系的基本成分模板:雙鏈或單鏈DNA引物:與模板DNA特異互補(bǔ)的單鏈寡聚核苷酸片段，一般18-30bp,上下游引物DNA聚合酶:如Taq酶（Thermus

aquaticus）底物:等濃度的四種核苷酸（dNTP）反應(yīng)環(huán)境:含有Mg2+的Tris-Cl緩沖液。含DNA聚合酶的2×反應(yīng)混合物第二十一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.PCR反應(yīng)體系的基本成分第二十二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。與模板DNA特異互補(bǔ)的單鏈寡聚核苷酸片段，一般18-30bp,上下游引物PCR反應(yīng)體系的基本成分濃度:

0.1umol～１umol/L

6×1012～3×1013[Primer]↑錯(cuò)配率↑

非特異性產(chǎn)物↑

引物二聚體↑第二十三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五引物設(shè)計(jì)原則引物長(zhǎng)度約為16-30bp，太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。引物中G+C含量通常為40%-60%四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng),以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。在引物內(nèi),尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ),以防出現(xiàn)引物二聚體,減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大,可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等.通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基第二十四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五引物的選擇與設(shè)計(jì)從文獻(xiàn)中查找利用引物設(shè)計(jì)軟件獲得：如Primer在線軟件Blast分析

NCBIBLASTNucleotideblast

直接找

第二十五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五TaqDNA聚合酶：TaqpolymeraseThermus

aquaticus5‘→3’DNA聚合酶活性以及5‘→3’核酸外切酶活性

無(wú)3'→5'核酸外切酶活性

致命弱點(diǎn)：出錯(cuò)率高LATaqpolymerase,PrimeStarDNApolymerase,PfuDNApolymerase，F(xiàn)astPfuDNApolymerasedNTP

：dATPdUTPdCTPdGTP一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為200~250μmol/L。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。PCR反應(yīng)體系的基本成分第二十六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五含Mg2+的反應(yīng)緩沖液：Mg2+濃度對(duì)TaqDNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實(shí)性,影響引物退火和解鏈溫度,影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。PCR反應(yīng)體系的基本成分濃度:1.０～４.5mmol/L[Mg2+]↑——

Product特異性↓[Mg2+]↓——

Product特異性↑Vary[Mg2+]instepsof0.5mM.第二十七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR體系的建立

25or50lsinamicroEppendorf(0.2ml)tube第二十八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR反應(yīng)的條件預(yù)變性：94℃，5min變性：94℃,30s,模板DNA變性成為單鏈退火：Tm-5℃,30s，引物與模板DNA結(jié)合延伸：72℃，與擴(kuò)增片段長(zhǎng)度有關(guān)，

<1Kb,1min；>1Kb,延長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)數(shù)：25-35，平臺(tái)期之前。最終延伸：72℃，10min。第二十九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五3-4hoursUVvisualisationThefinalproduct第三十頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五Tips：反應(yīng)體系混勻；正負(fù)對(duì)照必須有；反應(yīng)條件可以嘗試梯度，且只改變一個(gè)變量；根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)品牌的DNA聚合酶MasterMix;帶Loading的Mix；快速的；保真的；第三十一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RT-PCR定義：將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（ReverseTranscription）和cDNA的聚合酶鏈擴(kuò)增（PolymeraseChainReaction）聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。目前對(duì)目的基因的mRNA表達(dá)進(jìn)行定性和半定量分析的最常用方法。第三十二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RT-PCR步驟提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RNA提取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNAPCR：以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增合成目的片段。瓊脂糖凝膠電泳第三十三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RT-PCR應(yīng)用用途:

1.獲得目的基因全長(zhǎng)編碼序列，用于基因克隆2.檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平（定性、半定量）優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、敏感、便宜局限性：不能準(zhǔn)確反應(yīng)基因表達(dá)狀況RT-PCR/Q-PCR（Real-timeQuantitativePCR）第三十四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平結(jié)果分析保證內(nèi)參照均一的情況下，比較目的條帶常用的內(nèi)參有GAPDH、β-Actin等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。獲得目的基因全長(zhǎng)編碼序列，可用于進(jìn)一步基因克隆第三十五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五Tips：所用PCR循環(huán)數(shù)需要調(diào)整,以減少平臺(tái)效應(yīng)，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。；對(duì)于克隆的片段來(lái)說(shuō)：

盡量選擇保真性好的酶（pfu）進(jìn)行反應(yīng)；

普通的Taq酶擴(kuò)增效率會(huì)更好一些；

（末端帶A方便TA克?。?/p>

長(zhǎng)片段可以分段進(jìn)行擴(kuò)增，最后拼接起來(lái)

（Double-jointPCR；SLIC）第三十六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測(cè)序技術(shù)

DNA體外重組技術(shù)第三十七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒(Plasmid)：是一種獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子，大小從1-200kb不等；是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子?？少x予宿主細(xì)胞一定生物學(xué)性狀，如：抗生素抗性Ampr等。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開(kāi)宿主細(xì)胞則不能存活,而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對(duì)抗生素的抗性等。第三十八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五現(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定第三十九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒載體（vector）是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過(guò)組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測(cè)定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。第四十頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：分子量小、多拷貝、松馳控制型具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)能插入較大的外源DNA片段具有容易操作的檢測(cè)表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡(jiǎn)稱pBS）等。

第四十一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA包括3個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增收集和裂解細(xì)胞分離和純化質(zhì)粒DNA第四十二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

常用質(zhì)粒提取方法：煮沸法

堿裂解法

一般質(zhì)粒提取試劑盒三種形式(見(jiàn)后)：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)超螺旋DNA開(kāi)環(huán)DNA(OpencircularDNA,簡(jiǎn)稱ocDNA)線狀DNA(LinearDNA)

質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定第四十三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒鑒定方法：酶切電泳PCR鑒定測(cè)序序列比對(duì)質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定第四十四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測(cè)序技術(shù)

DNA體外重組技術(shù)第四十五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

酶切：用限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體，使其產(chǎn)生便于連接的末端。限制性內(nèi)切酶：限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。來(lái)源：細(xì)菌和真菌功能：以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5′端為P，3′端為OH。WernerArber、DanienNathans、HamiltonSmith1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第四十六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

限制性內(nèi)切酶命名：根據(jù)其來(lái)源命名。如：屬名菌株名

EcoRI

種名編號(hào)EcoRI來(lái)源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。酶來(lái)源的生物名稱縮寫屬名-種名-株名-發(fā)現(xiàn)次序第四十七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

分類：限制性核酸內(nèi)切酶根據(jù)識(shí)別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性分為三大類。

特性I型II型III型限制和修飾活性限制作用所需輔助因子特異性識(shí)別位點(diǎn)切割位點(diǎn)序列特異的切割在基因工程的應(yīng)用雙功能酶ATP、Mg2+非對(duì)稱序列距識(shí)別位點(diǎn)1000bp處隨機(jī)切割不是用處不大核酸內(nèi)切酶和甲基化酶分開(kāi)Mg2+回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)位于識(shí)別位點(diǎn)上是廣泛使用

雙功能酶

ATP、Mg2+

非對(duì)稱序列

距識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp處

是

用處不大第四十八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)及作用特性Ⅱ型酶限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和修飾酶兩種不同的酶組成。它的分子量小，僅需Mg2＋做輔助因子，它們能識(shí)別雙鏈DNA的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割。識(shí)別順序一般為4－6個(gè)堿基對(duì)，識(shí)別順序具有180度的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性，具有回文結(jié)構(gòu)。5’-CTGCAG-3’5’-GTTAAC-3’3’-GACGTC-5’3’-CAATTG-5第四十九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五Ⅱ型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生2種不同切口平末端：在識(shí)別順序的對(duì)稱軸上，對(duì)DNA同時(shí)切割形成平末端，如：SmaI5’－CCCGGG－3’3’－GGGCCC－5’5’－CCC3’－GGGGGG－3’CCC－5’質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

粘末端：5′突出粘末端：在識(shí)別序列的兩側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的5′末端切割產(chǎn)生5′端突出的粘性末端，如：HindIII5’－AAGCTT－3’3’－TTCGAA－5’5’－A3’－TTCGA－5’5’－AGCTT－3’A－5’3′突出粘末端:與5′突出粘末端作用相反，產(chǎn)生3′端突出粘末端，如：PstI5’－CTGCAG－3’3’－GACGTC－5’5’－CTGCA－3’3’－GG－3’3’－ACGTC－5’第五十一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶的單位

在適當(dāng)?shù)臈l件下（T，pH，離子強(qiáng)度等）一小時(shí)內(nèi)完全酶解1μg特定DNA底物所需要的限制性核酸內(nèi)切酶的量，定義為1個(gè)活性單位。目前常用的酶單位的定義是：37℃，1小時(shí)內(nèi)50ul反應(yīng)體系完全酶解1μgλDNA所需的酶量。

在建立酶切體系時(shí)，酶的用量一般為1－5U/μgDNA質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

影響酶切的因素DNA限制性內(nèi)切酶酶作用底物（DNA純度）反應(yīng)緩沖液鹽離子濃度（Mg2+）酶解溫度與時(shí)間第五十三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

DNA限制性內(nèi)切酶1.內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)及形成的粘性末端；2.內(nèi)切酶體積不能超過(guò)反應(yīng)體系10%，因內(nèi)切酶中含50%甘油作為保護(hù)劑，甘油濃度過(guò)高會(huì)影響酶切反應(yīng)；3.操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行（冰上）。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

酶作用底物DNA應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、乙醇等，這些因素的存在均不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活力。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五反應(yīng)緩沖液酶切緩沖液成分及作用：①Tris-HCl，維持pH在7.4－8.0；②Mg2+，內(nèi)切酶活性所必需；③NaCl/KCl，增加離子濃度，利于酶活性；④二硫蘇糖醇(DTT)，保護(hù)酶，防止二硫鍵的形成不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應(yīng)緩沖液。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五鹽離子濃度不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)鹽離子強(qiáng)度（Na+）有不同的要求.一般按離子強(qiáng)度不同分為低（10mmol/L）、中（50mmol/L）、高鹽（100mmol/L）三類。Mg2+是酶切反應(yīng)必需的。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五酶解溫度與時(shí)間溫度：大多數(shù)限制酶反應(yīng)溫度為37℃，也有的酶需在50℃或其他溫度下進(jìn)行反應(yīng)。時(shí)間：一般1-2小時(shí)即可，進(jìn)行大量DNA酶解反應(yīng)時(shí)，可酶解過(guò)夜。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五星號(hào)活力(Staractivity)限制性核酸內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，能夠切割一些與其特異識(shí)別順序類似的序列，這種現(xiàn)象稱為星號(hào)活力。星號(hào)活力出現(xiàn)的原因：酶用量太大>100U/ugDNA酶切體系中離子強(qiáng)度太低，<25mM正常為100－150mM質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第五十九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五甘油濃度過(guò)高>10％（V/V）EcoRI反應(yīng)體系pH值過(guò)高>8PstI一般反應(yīng)體系的pH為7.0左右反應(yīng)體系中存在有機(jī)溶劑，如乙醇，DMSO等有與Mg競(jìng)爭(zhēng)的其它二價(jià)陽(yáng)離子，如Mn離子質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第六十頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五應(yīng)用：構(gòu)建載體酶切片段及載體本身基因克隆時(shí)轉(zhuǎn)化子鑒定線性化載體質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

第六十一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五Tip

雙酶切Vs分步酶切

FermentasFastDigestNEB質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的酶切

不完全酶切第六十二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測(cè)序技術(shù)

DNA體外重組技術(shù)第六十三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：帶有相同的粘性末端：用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。帶有平末端：是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。重組DNA的連接

連接：是在一定條件下，由DNA連接酶（DNAligase）酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段相鄰的5′端磷酸與3′端羥基之間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程。

第六十四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第六十五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五重組DNA的連接

DNA連接酶主要分為兩種：T4DNA連接酶催化dsDNA粘末端連接及平端連接大腸桿菌連接酶不能催化平末端連接,其底物只能是帶缺口的雙鏈DNA分子和具有同源互補(bǔ)粘末端的不同DNA分子第六十六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五重組DNA的連接

T4DNA連接酶的特性

T4DNA連接酶是T4噬菌體基因30編碼的產(chǎn)物。最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的。分子量為68KD，需要ATP作為輔助因子并由ATP提供能量。第六十七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五重組DNA的連接

T4DNA連接酶緩沖液的成分及作用常用的反應(yīng)液為pH7.6的Tris－Hcl，連接最佳pH7.2-7.8需要ATP作為輔助因子并由ATP提供能量DTT等巰基化合物可促進(jìn)連接酶的連接作用高濃度的Na+,K+等抑制酶的活性第六十八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五重組DNA的連接

T4DNA連接酶的作用條件

對(duì)于粘性末端一般在12－15℃之間進(jìn)行反應(yīng)，比較通用的條件是16℃過(guò)夜連接。第六十九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五Tips：一般來(lái)說(shuō)粘性末端連接效率比平端高；連接反應(yīng)可提高溫度，縮短反應(yīng)時(shí)間；粘性末端鏈接保證方向性，平端盡量少用第七十頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測(cè)序技術(shù)

DNA體外重組技術(shù)第七十一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞（細(xì)菌：E.coli，真菌：Yeast，昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞）,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化第七十二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五感受態(tài)細(xì)胞：最常用E.coliDH5a菌株受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法,CaCl2

等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

第七十三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五為了提高轉(zhuǎn)化效率,實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5％

重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

第七十四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五試劑的質(zhì)量防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管,tip等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

第七十五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五初步篩選：抗性篩選、藍(lán)白斑篩選重組子鑒定：菌落PCR，酶切電泳檢測(cè)，測(cè)序技術(shù)重組質(zhì)粒的篩選

重組子篩選：在不同層次上、不同水平上進(jìn)行篩選，鑒定所需的特異性重組子。使用各種方法，將帶有重組載體的宿主菌從培養(yǎng)基中篩選出來(lái)。例如：載體大小，酶切結(jié)果，篩選標(biāo)記等。第七十六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五初步篩選：進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀?？剐院Y選：Amp+，Kan+,Neo+等α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選：藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒的篩選

藍(lán)白斑篩選第七十七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五重組質(zhì)粒的篩選

ColonyPCR（菌落PCR）菌落PCR可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省時(shí)少力。通常利用此方法進(jìn)行重組體的篩選或者DNA測(cè)序分析。第七十八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五菌落PCR的實(shí)驗(yàn)方法PCR混合物的制備（25μl）2×MasterMix12.5μlPrimer1（sense，10μM）

1μlPrimer2（antisense，10μM）1μlddH2O10.5μl重組質(zhì)粒的篩選

第七十九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五常溫下隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化板上的白色轉(zhuǎn)化子，用滅菌的槍頭挑取少量菌體，將沾有菌體的槍頭置于相應(yīng)的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數(shù)下（管子做好記號(hào)，將記號(hào)標(biāo)于側(cè)壁），蓋緊管子。+-第八十頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按以下條件擴(kuò)增。預(yù)變性：94℃5min變性：94℃30s復(fù)性+延伸：60℃1min補(bǔ)齊：72℃7min35個(gè)循環(huán)電泳檢測(cè)是否得到目的片段第八十一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五酶切電泳檢測(cè)，測(cè)序技術(shù)重組質(zhì)粒的篩選

+-第八十二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五RNA的提取和cDNA合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的酶切重組DNA的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選凝膠電泳測(cè)序技術(shù)

DNA體外重組技術(shù)第八十三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五凝膠電泳

瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。

注意：EB為強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,

注意操作，污染區(qū)域隔離

第八十四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。

凝膠電泳

第八十五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

凝膠電泳

第八十六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、瓊脂糖濃度

給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。小于0.5kb膠濃度是1.2-1.5%,大于10kb膠濃度為0.3-0.7%,于兩者之間

膠濃度為0.8-1.0%。

凝膠電泳

第八十七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、DNA分子的構(gòu)象

當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。

超螺旋DNA>線狀雙鏈DNA>開(kāi)環(huán)(相同分子量)

凝膠電泳

第八十八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五4、電源電壓

在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。

隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng),片段越大,因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大(即分子量大的片段越跑越快)因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過(guò)5v/cm。

凝膠電泳

第八十九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。

6、離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。

凝膠電泳

第九十頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五常用電泳緩沖液：TAE[含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸]TBE(Tris-硼酸和EDTA)TPE(Tris-磷酸和EDTA)一般配制成濃縮母液,儲(chǔ)于室溫。

凝膠電泳

第九十一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

瓊脂糖凝膠電泳用途：分離、鑒定、純化

DNA片段的主要方法，目前主要用于重組基因的分離、鑒定、限制性酶切圖譜分析、Southern、Northern雜交分析，以及PCR產(chǎn)物的分離鑒定等。PCR產(chǎn)物鑒定，分離純化基因克隆操作中重組質(zhì)粒鑒定酶切產(chǎn)物鑒定凝膠電泳

第九十二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第九十三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第九十四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五經(jīng)典的分子克隆方法第九十五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五具體操作過(guò)程中遇見(jiàn)過(guò)的問(wèn)題：目的基因中包含想用的酶切位點(diǎn)——不完全酶切載體上沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)——加上個(gè)位點(diǎn)？多個(gè)目的基因需要往同一個(gè)載體上連接——挨個(gè)查序列找酶切位點(diǎn)？第九十六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五更簡(jiǎn)單、快捷、高效的方法？第九十七頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五SLIC：sequenceandligation–independentcloningSLIC：是一種不依賴于基因序列和連接反應(yīng)的高效基因克隆新方法.T4DNAPolymerase：在dNTP和引物鏈存在的情況下，具有模板依賴的5’-3’DNA聚合酶活性；在無(wú)dNTP存在的情況下，具有3’-5’核酸外切酶活性第九十八頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建重組質(zhì)粒流程第九十九頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建重組質(zhì)粒效率30bp長(zhǎng)度的互補(bǔ)序列重組效率最高；RecA可以提高重組效率RecA的作用隨著DNA濃度加大減弱第一百頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建多片段重組質(zhì)粒3片段連接5片段連接10片段連接第一百零一頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建重組質(zhì)粒具體操作第一百零二頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五SLIC法構(gòu)建重組質(zhì)粒具體操作引物設(shè)計(jì)PCR獲得PTP1B序列（帶有一段與載體序列）T4DNAPolymerase處理混合第一百零三頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簶?gòu)建N末端攜帶Histag的PTP1B的表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)材料：pET-15b-EGFP(表達(dá)載體，N端攜帶Histag,洪梅構(gòu)建，已測(cè)序)pGEX-6p-2-PTP1B(fulllength)（PTP1BN端攜帶GSTtag）PCR反應(yīng)體系(TransStartFastPfuDNAPolymerase,EasyTaqDNAPolymerase)限制性內(nèi)切酶（XhoI、NdeI）實(shí)驗(yàn)方法（簡(jiǎn)易）：以pGEX-6p-2-PTP1B(fulllength)為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到PTP1B片段。雙酶切處理pET-15b-EGFP載體，得到pET-15b載體。將PTP1B片段插入pET-15b載體，構(gòu)建得到N末端攜帶Histag的PTP1B表達(dá)載體。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)下文。第一百零四頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒提取:使用TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒，提取方法見(jiàn)說(shuō)明說(shuō)。提取獲得pET-15b-EGFP質(zhì)粒，體積約為40ml，濃度未測(cè)。質(zhì)粒酶切處理:37oC孵育6h（此時(shí)如需暫停，可80oC加熱5min使限制性內(nèi)切酶失活，并置于-20oC保存）。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果（圖1）。配置1%的瓊脂糖凝膠(使用大孔梳子，用于膠回收)，上樣并電泳(使用新配的TAE緩沖液，電壓使用80~90V)，結(jié)果如圖3。使用OmegaGelExtractionKit回收目的片段，方法見(jiàn)說(shuō)明書。回收后的片段電泳檢測(cè)（圖4），隨后置于-20oC保存。pET-15b-EGFP雙酶切(ml)單酶切(ml)ddH2O46.510xFDbuffer(green)51NdeI1.50XhoI1.50.5Vector382Total5010

質(zhì)粒雙酶切處理用于后續(xù)SLIC，同時(shí)取出少部分質(zhì)粒單酶切處理做對(duì)照，反應(yīng)體系如下：M12M,Marker1,pET-15b-EGFP/XhoI2,pET-15b-EGFP/NdeI+XhoI圖1

pET-15b-EGFP酶切驗(yàn)證結(jié)果接種:一、待插入載體（pET-15b）的準(zhǔn)備接種50mlpET-15b-EGFP甘油菌至40mlLB(50mg/ml氨芐青霉素)，37oC,200rpm過(guò)夜培養(yǎng)。第一百零五頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、目的片段準(zhǔn)備PCR擴(kuò)增目的片段:PTP1B1-450(ml)120-450(ml)ddH2O31.531.55xTransStartFastPfubuffer10102.5mMdNTPs55oPX38610oPX38711oPX38801Template(PTP1Bfulllength)0.50.5TransStartFastPfuDNApolymerase11PCR反應(yīng)體系如下：引物設(shè)計(jì):根據(jù)SLIC原理，引物前15bp與載體互補(bǔ)(橙色標(biāo)記)，設(shè)計(jì)引物如下：oPX-386(PTP1B1-450ForwardprimerforSLIC):CGCGGCAGCCATATGGCTTTGGTCACGGTCCAGCoPX-387(PTP1B1-450ReverseprimerforSLIC):AGCCGGATCCTCGAGTCATTTGCTTGCCAGCAAGAToPX-388(PTP1B120-450ForwardprimerforSLIC):CGCGGCAGCCATATGGAAAGCATCGTCCTAGGAATGPCR循環(huán)如下：95oC2min95oC20s56oC20s72oC1min72oC5min30XPCR結(jié)束后電泳檢測(cè)結(jié)果（圖2）。配置1%的瓊脂糖凝膠(使用大孔梳子，用于膠回收)，上樣并電泳(使用新配的TAE緩沖液，電壓使用80~90V)，結(jié)果如圖3。使用OmegaGelExtractionKit回收目的片段，方法見(jiàn)說(shuō)明書。回收后的片段電泳檢測(cè)（圖4），隨后置于-20oC保存。M12M,Marker1,PTP1B1-4502,PTP1B120-450圖2

PTP1BPCR結(jié)果第一百零六頁(yè)，共一百一十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五圖3

載體和PCR產(chǎn)物在1%凝膠中的電泳結(jié)果PTP1B1-450PTP1B120-450pET-15b-EGFP/NdeI+XhoIM圖4載體和PCR凝膠回收后的電泳結(jié)果M123M,Marker1,PTP1B1-4502,PTP1B120-4503,pET-15b

凝膠回收后的載體和PCR產(chǎn)物體積約為40ml，片段電泳檢測(cè)顯示大小正常。使用K5600spectrophotometer檢測(cè)產(chǎn)物濃度（1ml即可），操作方法見(jiàn)使用說(shuō)明。載體及PCR產(chǎn)物定量濃度（ng/ul）PTP1B1-45019PTP1B120-450146pET