分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能_第1頁
分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能_第2頁
分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能_第3頁
分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能_第4頁
分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能_第5頁
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分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能第一頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五contentsNorthernBlot2SouthernBlot1WesternBlot3

酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)4第二頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五SouthernBlot原理與用途

原理:將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上,固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列,則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合,游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。用途:檢測(cè)樣品中的DNA及其含量,了解基因的狀態(tài),如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。第三頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五SouthernBlot操作步驟DNA瓊脂糖電泳

印跡轉(zhuǎn)移

預(yù)雜交

雜交(變性探針)

洗膜

放射自顯影或顯色。第四頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五SouthernBlot操作步驟:第五頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五轉(zhuǎn)膜方法毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法(向上、向下):DNA片段由液流攜帶而從凝膠轉(zhuǎn)移并聚集于固相支持物表面。液體通過毛細(xì)管作用抽吸過凝膠,借助于一疊干燥的吸水紙巾產(chǎn)生并維持毛細(xì)管作用。轉(zhuǎn)移的速率取決于DNA片段的大小和凝膠中的瓊脂糖的濃度,小片段DNA(<1kb)在1h內(nèi)就能從0.7%的瓊脂糖上定量的轉(zhuǎn)移。大片段轉(zhuǎn)移慢且效率低。如15kbDNA的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移至少要進(jìn)行18h,而且18h后轉(zhuǎn)移仍不完全。電轉(zhuǎn)移:需要使用帶電荷的尼龍膜來轉(zhuǎn)移,通常應(yīng)用于經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的小分子DNA片段。雙鏈DNA片段必須先經(jīng)過原位變性,隨后中和凝膠,并將其浸于電泳緩沖液中,最后將其夾放于大電泳槽內(nèi)平行電極之間的多孔板之間。完全轉(zhuǎn)移所需的時(shí)間取決于DNA片段的大小、凝膠的孔隙度以及外加電場(chǎng)的強(qiáng)度。通常在2-3小時(shí)內(nèi)可以轉(zhuǎn)移完畢。真空轉(zhuǎn)移:在真空條件下,DNA或RNA可以從凝膠上快速并定量地轉(zhuǎn)移。目前商品供應(yīng)的真空轉(zhuǎn)移裝置有數(shù)種。真空轉(zhuǎn)移較毛細(xì)管轉(zhuǎn)移更為有效,且更為快捷,一般30分鐘-60分鐘即可完成轉(zhuǎn)移。如果小心操作,經(jīng)真空轉(zhuǎn)移獲得的雜交信號(hào)比毛細(xì)管法增強(qiáng)2-3倍。第六頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五Southern印跡及雜交所使用膜的性質(zhì)

性質(zhì)硝酸纖維素膜中性尼龍膜帶電荷的尼龍膜結(jié)合容量(g核酸/CM2)80-120約100400-500實(shí)現(xiàn)最大結(jié)合能力所需的核酸大小>400bp>50bp>50bp固定真空條件下80C烘烤2h70C烘烤1h,無需真空條件;真空條件下80C烘烤2h70C烘烤1h,無需真空條件;或者溫和的堿性條件或者254nm紫外照射;潮濕的膜暴露于1.6kJ/m2;干燥的膜暴露于160kJ/m2商業(yè)產(chǎn)品Hybond-NGene-ScreenHybond-N+;Zeta-Probe;Nytran+;Gene-ScreenPlus第七頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五

轉(zhuǎn)膜過程示意圖第八頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五探針標(biāo)記技術(shù)1標(biāo)記物:放射性和非放射性兩種放射性:32P,35S。非放射性:生物素、地高辛、熒光素。2、標(biāo)記方法(1)切口平移法:最經(jīng)典。(2)隨機(jī)引物法:最常用。(3)末端標(biāo)記法。(4)單鏈DNA探針標(biāo)記。(5)寡核苷酸探針標(biāo)記法。第九頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五

放射性探針的標(biāo)記方法1、切口平移法:目前已經(jīng)很少使用。2、隨機(jī)引物法:DNA聚合酶可沿單鏈模板起始DNA的合成。如果寡核苷酸的序列是隨機(jī)的,它們就可在模板的多位點(diǎn)上與模板雜交。因此模板上每一核苷酸的互補(bǔ)物將以同樣的頻率摻入產(chǎn)物。用一種[-32P]標(biāo)記的dNTP及其他三種非標(biāo)記dNTP作為前體合成標(biāo)記DNA,可產(chǎn)生比活為5108-5109dpm/g的探針。第十頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五

SouthernBlot操作要點(diǎn)一般Southern雜交每一個(gè)電泳通道需要10-30μg的DNA。為保證消化完全,一般用2-4U的酶消化1μg的DNA。消化的DNA濃度不宜太高,以0.5μg/μl為好,加入反應(yīng)體系的酶體積不能超過1/10,DNA樣品一定要消化完全。如果需要兩種酶消化DNA,而兩種酶的反應(yīng)條件可以一致,則兩種酶可同時(shí)進(jìn)行消化;如果反應(yīng)條件不一致,則先用需要低離子強(qiáng)度的酶消化,然后補(bǔ)加鹽類等物質(zhì)調(diào)高反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度,再加第二種酶進(jìn)行消化。標(biāo)記后的探針可以直接使用或過柱純化后使用。由于-32P的半衰期只有14天,所以標(biāo)記好的探針應(yīng)盡快使用。探針的比活性最好大于109計(jì)數(shù)/分/μl。鮭魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉(zhuǎn)移的位點(diǎn),降低雜交背景、提高雜交特異性。

第十一頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五SouthernBlot操作要點(diǎn)在洗膜的過程中,不斷振搖,不斷用放射性檢測(cè)儀探測(cè)膜上的放射強(qiáng)度。實(shí)踐證明,當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時(shí),是洗膜的終止點(diǎn)。上述洗膜過程無論在哪一步達(dá)到終點(diǎn),都必須停止洗膜。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱決定曝光時(shí)間,一般在1-3天時(shí)間。洗片時(shí),先洗一張X光片,若感光偏弱,則再多加兩天曝光時(shí)間,再洗第二張片子。

影響Southern雜交實(shí)驗(yàn)的因素很多,主要有:DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉(zhuǎn)移效率、探針比活性和洗膜終止點(diǎn)等。第十二頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五

SouthernBlot注意事項(xiàng)1.要取得好的轉(zhuǎn)移和雜交效果,應(yīng)根據(jù)DNA分子的大小,適當(dāng)調(diào)整變性時(shí)間。對(duì)于分子量較大的DNA片段(大于15kb),可在變性前用0.2MHCl預(yù)處理10min使其脫嘌呤。2.轉(zhuǎn)移用的膜要預(yù)先在雙蒸水中浸泡使其濕透,否則會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效果;不可用手觸摸膜,否則影響DNA的轉(zhuǎn)移及與膜的結(jié)合。3.轉(zhuǎn)移時(shí),注意膜與凝膠及濾紙間不能留有氣泡,以免影響轉(zhuǎn)移效果。4.注意同位素的安全使用。5.進(jìn)行Southern雜交的探針一般用放射性物質(zhì)標(biāo)記或用地高辛標(biāo)記。放射性標(biāo)記靈敏度高,效果好;地高辛標(biāo)記沒有半衰期,安全性好。第十三頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五SouthernBlot常見問題分析1、DNA太少,雜交的敏感度不夠高;2、DNA太多,酶切不完全,雜交條帶不完全;3、使用太高電壓電泳:膠熔化或電泳條帶沒有完全分開;4、預(yù)雜交時(shí)封閉不完全:背景高,出現(xiàn)無法解釋的結(jié)果;5、洗膜不充分:背景高,出現(xiàn)無法解釋的結(jié)果;6、過度洗膜:特異性結(jié)合的核酸條帶被洗掉;第十四頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五一張同位素放射自顯影的Southernblot照片第十五頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五

一張地高辛顯色的Southernblot照片第十六頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五Southernblot操作視頻第十七頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五NorthernBlot原理:在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,繼而按照同SouthernBlot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。用途:檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)及其含量。第十八頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五NorthernBlot操作過程

RNA提取

甲醛變性電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交(變性探針)洗膜放射自顯影或化學(xué)發(fā)光第十九頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五Northernblot操作注意事項(xiàng)1.基本注意事項(xiàng)和Southernblot相似;2.獲得高質(zhì)量的RNA是做好Northernblot的關(guān)鍵;3.操作過程要小心、仔細(xì),防止RNA樣品的降

解。第二十頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五Northernblot操作視頻第二十一頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五WesternBlot原理:將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上,然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng),洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后,加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體,反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體,加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等,觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn),也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。第二十二頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五Westernblot操作過程SDS電泳

轉(zhuǎn)膜(PVDF或硝酸纖維素膜)封閉一抗洗滌酶標(biāo)二抗反應(yīng)洗滌顯色或化學(xué)發(fā)光顯影。第二十三頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五

SDS-PAGE電泳示意圖第二十四頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五電泳后轉(zhuǎn)膜,然后用特定的抗體來檢測(cè)靶蛋白第二十五頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五第二十六頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3.IM9/Bcl-2Cellsweretreatedwith20Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrolHours04816第二十七頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問題(1)蛋白質(zhì)電泳:常用SDS:?jiǎn)我粊喕M成的蛋白質(zhì)非變性PAGE:多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)Tris-Tricine膠電泳:用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳,能夠獲得較好的分離效果。聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時(shí)要戴手套!第二十八頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問題(2)轉(zhuǎn)膜:戴手套,避免用手接觸濾紙、凝膠和膜,因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致!以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜15-30min,如果是PVDF膜,必須先用甲醇激活后浸泡。方向正確:凝膠在陰極,膜在陽極。排去濾紙、膠和膜間的氣泡。電轉(zhuǎn)時(shí)間:100V1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活選擇。轉(zhuǎn)移結(jié)束后,凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率。膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置。第二十九頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問題(3)封閉:用5%脫脂奶粉或3%BSA。(含0.1%Tween20TBS或PBS配制)時(shí)間:室溫2h或4oC過夜第三十頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問題(4)顯色或顯影:顯色:辣根過氧化物酶:底物為DAB。堿性磷酸酶:底物為BCIP/NBT?;瘜W(xué)發(fā)光顯影:最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物(商品化產(chǎn)品)注意:化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次,

曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定。第三十一頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五WesternBlot實(shí)驗(yàn)注意的問題(5)膜的再利用:化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用StrippingBuffer洗滌后(洗滌Buffer:62.5mmpH6.7的Tris-HCI含2%SDS和100mm的-2ME),用不同的一抗進(jìn)行雜交,檢測(cè)其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用3-4次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交。第三十二頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五Westernblot操作視頻第三十三頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五ELISA原理:ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí),受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定方法具有很高的敏感度(pg-ng/ml水平),并且重復(fù)性好。第三十四頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五ELISA常用的酶和底物

辣根過氧化物酶,底物為OPD,深桔黃色,檢測(cè)波長(zhǎng)492nm;底物為TMB,藍(lán)綠色,檢測(cè)波長(zhǎng)450nm。

堿性磷酸酶,底物為PNPP(對(duì)-消基苯磷酸酯),黃色,檢測(cè)波長(zhǎng)405nm。

ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間:

包被:24-36h,蛋白濃度為1-5ug/ml。

封閉:37oC2h

或4oC過夜(3%BSA)。

樣本反應(yīng)時(shí)間:37oC45min-1h。

酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間:37oC45min-1h。顯色時(shí)間:15min(避光)。

實(shí)驗(yàn)要設(shè)對(duì)照。

可以一次包被多塊板,凍存?zhèn)溆?。第三十五頁,共四十一頁,編輯?023年,星期五ELISA的類型1.間接法測(cè)抗體:間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體,檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。常用于臨床血清中自身抗體的檢測(cè),以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測(cè)。方法:抗原包被封閉待檢抗體洗滌酶標(biāo)二抗洗滌顯色反應(yīng)終止反應(yīng)ELISAReader檢測(cè)OD值。第三十六頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五ELISA的類型2.雙抗體夾心法測(cè)抗原:是檢測(cè)抗原最常用的方法。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。常用的組合:?jiǎn)慰寺】贵w+多克隆抗體

單克隆抗體+單克隆抗體

后一組合是兩種單克隆抗體針對(duì)抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。用途:測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,但不適用

于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原,因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測(cè)。第三十七頁,共四十一頁,編輯于2023年,星期五ELISA的類型3.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原:(1)抗體固相測(cè)抗原:小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定,可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,最后的顯色也愈淺。方法:抗體包被封閉同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原洗滌酶底物顯色E

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