X射線晶體衍射測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)課件

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定2011-3-30蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定方法及數(shù)量蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定年增長(zhǎng)圖第一節(jié)：X-射線衍射技術(shù)用于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定原理n基本過程n優(yōu)缺點(diǎn)n應(yīng)用實(shí)例n一、相關(guān)原理光的衍射現(xiàn)象nnX射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用本質(zhì)的爭(zhēng)論nnX射線衍射的發(fā)現(xiàn)晶體學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)X射線晶體衍射nn1.光的衍射現(xiàn)象‘光線’拐彎了！?當(dāng)縫的大?。ɑ蛘系K物的大小）跟波長(zhǎng)相差不多時(shí)就發(fā)生明顯的衍射現(xiàn)象．如果縫很寬，其寬度遠(yuǎn)大于波長(zhǎng)，則波通過縫后基本上是沿直線傳播的，衍射現(xiàn)象就很不明顯了．惠更斯—菲涅耳原理惠更斯：光波陣面上每一點(diǎn)都可以看作新的子波源，以后任意時(shí)刻，這些子波的包跡就是該時(shí)刻的波陣面?！?690年解釋不了光強(qiáng)分布！菲涅耳補(bǔ)充：從同一波陣面上各點(diǎn)發(fā)出的子波是相干波?！?818年2.X射線的發(fā)現(xiàn)歷程及應(yīng)用失之交臂n1836法拉第

發(fā)現(xiàn)陰極射線qq1861克魯克斯

陰極射線管在放電時(shí)會(huì)產(chǎn)生亮光

干版和光片有問題？1890古德斯柏德

洗出了一張X射線的透視底片

照片的沖洗藥水或沖洗技術(shù)q發(fā)現(xiàn)X射線本質(zhì)的爭(zhēng)論X射線衍射nnn2.X射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用1895年

倫琴（Roentgen）發(fā)現(xiàn)故稱為倫琴射線。n倫琴夫人的手的X射線照片X射線在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用倫琴的新發(fā)現(xiàn)轟動(dòng)了全世界,不到三個(gè)月,維也納的一n家醫(yī)院便拍出了應(yīng)用于醫(yī)療的X射線照片.從此,X射線拍片和射線透視成為醫(yī)學(xué)診療中常用的手段。為了防止各臟器成像發(fā)生的重疊給診療帶來(lái)不便,科n學(xué)家們進(jìn)一步研究了成像更清晰、靈敏度更高的儀器。1972年，英國(guó)科學(xué)家漢斯菲爾德運(yùn)用計(jì)算機(jī)和圖像重建理論,制成了電子計(jì)算機(jī)射線斷層掃描成像裝置,也就是已被廣泛應(yīng)用的CT。X射線與諾貝爾獎(jiǎng)—物理學(xué)獎(jiǎng)n

倫琴因發(fā)現(xiàn)X射線而獲得第一屆諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n

1903年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n

1906年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n

勞厄獲得了1914年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n

英國(guó)的布拉格父子1915年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n

英國(guó)的巴克拉1917年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n

瑞典物理學(xué)家西格班1924年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n

美國(guó)的康普頓1927年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。n

前蘇聯(lián)的切連科夫1958年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng);n

美國(guó)的霍夫斯塔特1961年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng);n

瑞典的西格巴恩1981年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。化學(xué)獎(jiǎng)荷蘭的物理化學(xué)家德拜1936年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n美國(guó)著名化學(xué)家鮑林1954年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n英國(guó)生物學(xué)家肯德魯與佩魯茨1962年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n英國(guó)女化學(xué)家霍奇金1964年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n美國(guó)化學(xué)家利普斯科姆1976年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n英國(guó)化學(xué)家桑格和美國(guó)化學(xué)家吉爾伯特1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n英國(guó)生物化學(xué)家克盧格因1982年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng);n美國(guó)化學(xué)家豪普特曼和卡爾1985年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng);n1988年,米歇爾等三位德國(guó)生物化學(xué)家諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。n3.X射線本質(zhì)的爭(zhēng)論X射線本質(zhì)的爭(zhēng)論--波動(dòng)說(shuō)巴克拉：

X射線波動(dòng)性標(biāo)識(shí)譜線：不管元素已化合成什么化合物，它們總是發(fā)射一種硬度的X射線，當(dāng)原子量增大時(shí)，標(biāo)識(shí)X射線的穿透本領(lǐng)會(huì)隨著增大。這說(shuō)明X射線具有標(biāo)識(shí)特定元素的特性。X射線本質(zhì)的爭(zhēng)論—微粒說(shuō)布拉克父子X射線微粒論者粒子具有旋轉(zhuǎn)性4.X射線衍射X射線衍射的獲得波長(zhǎng)范圍：10—0.1埃n欲觀察其衍射現(xiàn)象則衍射線度應(yīng)與其波長(zhǎng)差不多，晶體的晶格常n數(shù)恰是這樣的線度衍射波的兩個(gè)基本特征—衍射線（束）在空間分布的方位（衍射n方向）和強(qiáng)度與晶體內(nèi)原子分布規(guī)律（晶體結(jié)構(gòu)）密切相關(guān)。X射線晶體結(jié)構(gòu)分析？nü

使用X射線作為物理工具，依賴X射線衍射現(xiàn)象為物理原理，以晶體作為研究對(duì)象，晶體結(jié)構(gòu)作為研究結(jié)果的一種分析方法。5.X射線的獲得：X射線管激光等離子體X射線激光同步輻射6.晶體基礎(chǔ)什么是晶體n晶體的周期排布n晶體的對(duì)稱性n3.1什么是晶體固體物質(zhì)n晶體q相當(dāng)罕見的東西？n非晶體q晶體(Crystal

)n指離子、原子或分子這些微粒在三維空間中周期性重復(fù)ü排列形成的、能夠給出明銳衍射的固體結(jié)構(gòu)。晶體什么樣（1）晶體什么樣（2）晶體什么樣（3）晶體什么樣（4）2.晶體和點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)晶體的周期性結(jié)構(gòu)使得我們可以把它抽象成“n點(diǎn)陣”來(lái)研究.一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點(diǎn)陣q二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點(diǎn)陣q三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點(diǎn)陣q一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點(diǎn)陣二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點(diǎn)陣三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點(diǎn)陣晶胞(Unit

cell)n空間點(diǎn)陣的單位（大小和形狀完全相同的平行六面體），是晶體結(jié)構(gòu)的最小單位。ü同一個(gè)空間點(diǎn)陣，劃分平行六面體的方式是多種多樣的。ü選擇平行六面體的原則：n①所選平行六面體的對(duì)稱性應(yīng)符合整個(gè)空間點(diǎn)陣的對(duì)稱性。q②

選擇棱與棱之間直角關(guān)系為最多的平行六面體q③

所選平行六面體之體積應(yīng)最小。q④

當(dāng)對(duì)稱性規(guī)定棱間的交角不能為直角關(guān)系時(shí)，應(yīng)選擇結(jié)點(diǎn)間距q小的行列作為平行六面體的棱，且棱間的交角接近于直角的平行六面體。單位平行六面體，a、b、c、、、

是表征它本身形狀、大小的一組參數(shù)，稱為格子參數(shù)或點(diǎn)陣參數(shù)。cba單位平行六面體參數(shù)單位平行六面體與坐標(biāo)軸的關(guān)系：棱交角＝坐標(biāo)軸之間交角。a、b、c＝軸單位。a、b、c、、、

關(guān)系有七種情況，與單位平行六面體七種格子相對(duì)應(yīng)。立方格子a=b=c==

=90o三方格子a=b=c==

≠90

，o60，109

28'16"o菱面體格子中α為特殊角度時(shí)，演變成的三種立方體格子四方格子a=b≠

c

==

=90o六方格子ooa=b≠c

==90

=120正交格子a≠

b≠

c

==

=90o單斜格子ooa≠

b≠

c

=

=90

≠90三斜格子a≠b

≠c

≠

≠

≠

90o按結(jié)點(diǎn)位置，可有四種不同的類型：P——原始格子（角頂）C——底心格子（角頂、頂?shù)酌妫㊣——體心格子（角頂、體心）F——面心格子（角頂、每個(gè)面）P——

原始格子（角頂）C——底心格子（角頂、頂?shù)酌妫㊣——體心格子（角頂、體心）F——面心格子（角頂、每個(gè)面）結(jié)構(gòu)中代表各類等同點(diǎn)的結(jié)點(diǎn)在空間的排列方式來(lái)說(shuō)，格子的種類有、且只有十四種。衍射方向二、X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定基本過程①蛋白質(zhì)獲?。ㄌ峒儯诰w生長(zhǎng)并經(jīng)冷凍技術(shù)處理③重原子衍生物制備④衍射數(shù)據(jù)收集⑤衍生數(shù)據(jù)分析和改進(jìn)⑥結(jié)構(gòu)模型的獲取（包括修正）（2）晶體生長(zhǎng)過程及影響因素晶核（盡量少）n微晶（可用作晶種）n晶體在數(shù)小時(shí)至數(shù)月后出現(xiàn)n2個(gè)問題：n是鹽晶嗎？①能給出有用的衍射嗎？（多晶/雙晶）②（2）晶體生長(zhǎng)過程及影響因素影響因素n物理因素：溫度、壓力、震動(dòng)、溶劑清潔度、試劑v純度、重力、外加物理場(chǎng)等生物化學(xué)因素：pH、離子強(qiáng)度、沉淀劑/添加劑的v類型和濃度等其他：溶液過飽和度、純度等v“經(jīng)驗(yàn)”

“機(jī)器人”（3）結(jié)晶方法批量結(jié)晶法

batchcrystallizationn透射法

crystallizationbydialysis液相擴(kuò)散法

liquiddiffusion氣相擴(kuò)散法vapordiffusion氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)nnnnEnhancedamidehydrogen/deuterium-exchangemassspectrometry,DXMS生物玻璃bioglassn（4）晶體的初步鑒定小分子晶體蛋白質(zhì)晶體邊界完整，漂亮常不完整，易出現(xiàn)多晶硬度偏硬，易碎成2瓣或幾瓣偏軟，易碎成粉脫水不變化慢因脫水而變壞溶解性偏光性染色性漂浮性快強(qiáng)相對(duì)弱強(qiáng)弱下沉漂?。?）衍射數(shù)據(jù)收集晶體的處理：低溫液氮?dú)饫淞骷夹g(shù)n數(shù)據(jù)收集儀：底片、面探測(cè)器n衍射分析儀器的發(fā)展n

射線種類：連續(xù)射線

特征射線

電子衍射

中子衍射?

探測(cè)技術(shù)：膠片

閃爍體計(jì)數(shù)器（點(diǎn)）

（IP）CCD探測(cè)器（面）圖2-22

石英的衍射儀計(jì)數(shù)器記錄圖（部分）*右上角為石英的德拜圖，衍射峰上方為（hkl）值，β代表Kβ衍射底片（外森堡相機(jī)、徘循相機(jī)）優(yōu)點(diǎn)：n多點(diǎn)同時(shí)收集ü容易保存ü價(jià)格便宜ü缺點(diǎn)q存在“化學(xué)霧”背景和X射線散射背景o費(fèi)時(shí)、費(fèi)力o計(jì)數(shù)管（四圓衍射儀）將X射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，信號(hào)放大后n再轉(zhuǎn)換成數(shù)字存入計(jì)算機(jī)隨時(shí)調(diào)用逐點(diǎn)收集數(shù)據(jù)n優(yōu)缺點(diǎn)與底片相反n面探技術(shù)-SMARTAPEX-CCD衍射儀SmartCCDOverviewSMARTAPEX-CCD探測(cè)器面探技術(shù)-SMARTAPEX-CCD衍射儀金屬絲構(gòu)成的面板，可同時(shí)多點(diǎn)收集n將X射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)n集計(jì)數(shù)管的精確和底片的多點(diǎn)收集效率n圖像板imageplate面探測(cè)器的改進(jìn)n由化學(xué)材料構(gòu)成，整塊板子密度一致n高分辨率n可見光下可測(cè)量n集底片和面探測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)于一身n（6）數(shù)據(jù)分析電子密度修飾n電子密度圖詮釋n結(jié)構(gòu)模型精化n數(shù)據(jù)處理軟件：Denzo,Scalepack三、X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定優(yōu)點(diǎn)分辨率高n不損傷樣品n無(wú)污染n相對(duì)快捷n能得到晶體完整性的大量信息n四、X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定存在問題晶體構(gòu)象是靜態(tài)的，不能測(cè)定不穩(wěn)定的過渡態(tài)n的構(gòu)象；很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶；（瓶頸）nnX射線晶體衍射的工作流程較長(zhǎng)。Last

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PDT五、應(yīng)用實(shí)例1.胰島素于1971年和1972年分別得