基因在大腸桿菌和酵母的高效表達(dá)

基因在大腸桿菌和酵母的高效表達(dá)第一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五本章目錄4.1基因的表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)策略4.1.1基因的表達(dá)系統(tǒng)4.1.2根據(jù)表達(dá)蛋白用途選擇基因的表達(dá)策略4.2基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)4.2.1基于T7噬菌體RNA聚合酶/啟動(dòng)子的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)4.2.2蛋白質(zhì)的融合表達(dá)4.2.3蛋白質(zhì)的分泌型表達(dá)4.2.4蛋白質(zhì)的包含體形式表達(dá)與蛋白質(zhì)復(fù)性4.3基因在酵母中的高效表達(dá)4.3.1酵母表達(dá)系統(tǒng)概述4.3.2甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)4.3.3組織纖溶酶原激活劑在甲醇酵母中的表達(dá)

第二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)基因的表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)策略

基因的表達(dá)系統(tǒng)基因的高效表達(dá)策略第三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五一、基因的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體的組成：DNA復(fù)制及質(zhì)粒DNA的篩選:有DNA復(fù)制起點(diǎn)ori,及Amp,Tet抗性基因目的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控系統(tǒng):這一系統(tǒng)包括啟動(dòng)子,抑制物基因和轉(zhuǎn)錄終止子.啟動(dòng)子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng):包括核糖體識別位點(diǎn)SD,翻譯起始密碼子和終止密碼子.第四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五表達(dá)系統(tǒng)的種類原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)

酵母植物擬南芥昆蟲哺乳動(dòng)物細(xì)胞系第五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五一）

原核表達(dá)系統(tǒng)：細(xì)菌第六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定基因克隆及表達(dá)系統(tǒng)成熟完善全基因組測序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物第七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素第八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五二）真核表達(dá)系統(tǒng)第九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認(rèn)定為安全的酵母表達(dá)系統(tǒng)第十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可以懸浮培養(yǎng),生長快,連續(xù)傳代精確的糖基化胞外表達(dá)人本身的細(xì)胞系，人的表達(dá)系統(tǒng)第十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五二、基因的高效表達(dá)策略用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究：重點(diǎn)考慮如何保持蛋白質(zhì)原有的功能表達(dá)蛋白用作抗原：合成天然蛋白及表達(dá)融合蛋白的策略,考慮如何便于分離

用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究：形成可溶性蛋白質(zhì)，保持結(jié)構(gòu)完整第十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)

大腸桿菌高效表達(dá)設(shè)計(jì)

基于T7噬菌體RNA聚合酶/啟動(dòng)子的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)的融合表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌型表達(dá)蛋白質(zhì)的包含體形式表達(dá)與蛋白質(zhì)復(fù)性第十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五一、外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的設(shè)計(jì)啟動(dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)?？截悢?shù)第十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五1.啟動(dòng)子啟動(dòng)子的構(gòu)建-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動(dòng)子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac第十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五啟動(dòng)子啟動(dòng)子的可控性P乳糖啟動(dòng)子Plac的可控性：OPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）基底水平轉(zhuǎn)錄第十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五啟動(dòng)子啟動(dòng)子的可控性Plac乳糖啟動(dòng)子Plac的可控性：OPlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝基底水平轉(zhuǎn)錄基因工程中使用的乳糖啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄第十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)：①位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列：5’

UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它與大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’

AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合；②翻譯起始密碼子AUG；③SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離(7bp)及堿基組成；④基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列第十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五二、

基于T7噬菌體RNA聚合酶/啟動(dòng)子的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：1）T7噬菌體RNA聚合酶合成RNA的速度高于大腸桿菌5倍；2）T7噬菌體RNA聚合酶只識別自己的啟動(dòng)子序列，不啟動(dòng)大腸桿菌DNA任何序列的轉(zhuǎn)錄；3）T7噬菌體RNA聚合酶對抑制大腸桿菌RNA聚合酶的抗生素有抗性；4）T7噬菌體RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)在一定條件下，基因表達(dá)產(chǎn)物可占細(xì)胞總蛋白的25％以上。第十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五載體與受體系統(tǒng)載體：pET表達(dá)系統(tǒng)（pET15，pET16，pET28，pET30，pET42等a/b/c三套，及pRSET）

大腸桿菌菌株：BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。(DE3)菌株基因組上以溶原形式攜帶一個(gè)克隆的T7RNA聚合酶基因，IPTG（異丙基硫代β－D－半乳糖苷）可誘導(dǎo)T7RNA聚合酶大量合成。第二十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五T7啟動(dòng)子pET28a結(jié)構(gòu)MCSlacZ第二十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五三、蛋白質(zhì)的融合表達(dá)

蛋白質(zhì)融合表達(dá)是指外源基因與載體已有的擔(dān)體蛋白的編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)新的開放閱讀框進(jìn)行表達(dá)。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常載體的擔(dān)體蛋白部分位于N端，目的蛋白位于C端。通過人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收目的蛋白。第二十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)pGEX載體第二十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)啟動(dòng)子擔(dān)體基因接頭目的基因MetArgStop

Ile-Glu-gly-Arg凝血因子Xa的識別、作用序列Ile-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回收第二十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五用于融合蛋白構(gòu)建的擔(dān)體蛋白：融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）

維持良好空間構(gòu)象金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）

免疫親和層析pRIT2T硫氧化還原蛋白（TrxA）

維持良好空間構(gòu)象pTrxFusb-半乳糖苷酶（LacZ）

免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）

維持良好空間構(gòu)象第二十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)

目的蛋白穩(wěn)定性高目的蛋白易于分離目的蛋白表達(dá)率高目的蛋白溶解性好目的蛋白需要回收第二十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五目的蛋白的回收化學(xué)斷裂法：如溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段。酶促裂解法第二十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五酶促裂解法：單殘基位點(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶

Arg-C葡萄球菌蛋白酶

Glu-C假單孢菌蛋白酶

Lys-C豬胰蛋白酶

Arg-C

Lys-CArgCNNC擔(dān)體蛋白目的蛋白每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇單殘基位點(diǎn)斷裂的蛋白酶如在精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，使目的蛋白分離第二十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)啟動(dòng)子擔(dān)體基因接頭目的基因MetArgStop

Ile-Glu-gly-Arg凝血因子Xa的識別、作用序列Ile-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回收第二十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五四、蛋白質(zhì)的分泌型表達(dá)

是指周質(zhì)蛋白、細(xì)胞內(nèi)膜與外膜蛋白等以帶有N端信號肽的前體形式首先在細(xì)胞質(zhì)中合成，隨后穿膜運(yùn)送到周質(zhì)或定位到內(nèi)、外膜上的分泌過程。穿膜過程中，信號肽被信號肽酶切除。將目的蛋白的基因置于原核蛋白信號肽的序列的下游可能實(shí)現(xiàn)分泌型表達(dá)。第三十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五分泌表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)：

①信號肽被切除后的蛋白質(zhì)N末端的氨基酸序列與天然蛋白是一致的②周質(zhì)空間中的蛋白酶活性比細(xì)胞質(zhì)中的要低，從而使蛋白質(zhì)較穩(wěn)定地存在于周質(zhì)中③周質(zhì)中只有少量的細(xì)菌蛋白，使分離純化更容易④周質(zhì)空間存在一個(gè)氧化的環(huán)境，使得二硫鍵更容易形成第三十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五五蛋白質(zhì)的包含體形式表達(dá)與蛋白質(zhì)復(fù)性

在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。

第三十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五能簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定

包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅第三十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象的目標(biāo)蛋白。第三十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體。第三十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體的變性與復(fù)性操作（1）包涵體的溶解與變性拆開錯(cuò)配的二硫鍵和次級鍵能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括：清洗劑：SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化促溶劑：鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)混合溶劑：如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH：廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)第三十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體的變性與復(fù)性操作（2）包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是：將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性第三十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性分段稀釋法，逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐?；?，蛋白帶負(fù)電，抑制集聚分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表達(dá)第三十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的重折疊（refolding）：二硫鍵形成HSHSSS+2e+2H+AHSHSS-S-RHS+BR-S-S-RSS2R-SH化學(xué)氧化法（A）需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊二硫鍵交換（B）需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好第四十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五六、利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成人胰島素的生產(chǎn)方法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建第四十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的特異性肽酶NC信號肽B肽C肽A肽信號肽酶第四十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五基因工程法制人胰島素1982年，美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。第四十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達(dá)法tactacb-Galb-GalApeptideBpeptideorioriAprAprMetMetMetMetMMNCMMNC化學(xué)合成A鏈和B鏈的編碼序列第四十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達(dá)法MMNCMMNCb-Galb-GalABCNBr處理NCSSSSCNSSNCNCNCNCCys體外氧化和重折疊分離純化第四十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建由于A鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有10%-20%，因此采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá)100美元以上。為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，美國ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。A鏈和B鏈分別表達(dá)法第四十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建人胰島素原表達(dá)法tacb-GalCpeptideoriAprMetMetMMNCBpeptideApeptide人胰島素原的cDNA重組人胰島素原轉(zhuǎn)化分離純化第四十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建人胰島素原表達(dá)法SSSSCN胰蛋白酶CpeptideApeptideBpeptideMRRKRCNBrRSSSSCNNCSSSSR羧肽酶BB鏈中第22位上的Arg和第29位上的Lys由于良好折疊的原因，對胰蛋白酶不敏感第四十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建人胰島素原表達(dá)法

在人胰島素原表達(dá)工藝中，由于C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對二硫鍵的正確配對率也相應(yīng)提高，折疊率高達(dá)80%以上。雖然這條工藝路線并不比AB鏈分別表達(dá)法更為簡捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元。目前美國ElyLiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。第四十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)基因在酵母中的高效表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)概述甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)組織纖溶酶原激活劑在甲醇酵母中的表達(dá)第五十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五一酵母表達(dá)系統(tǒng)概述優(yōu)點(diǎn)：克服大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的不足，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾合加工。缺點(diǎn)：缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，分泌效率差，表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定，表達(dá)質(zhì)粒易于丟失等。第五十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五酵母宿主菌釀酒酵母系統(tǒng)：酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)如：畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）第五十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期五酵母菌的轉(zhuǎn)化程序酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法第五十三頁，共五十七頁，編輯于20