淺論人乙型肝炎病毒聚合酶在釀酒酵母中的表達(dá)

淺論人乙型肝炎病毒聚合酶在釀酒酵母中的表達(dá)【摘要】目的嘗試在酵母中表達(dá)人乙型肝炎聚合酶蛋白，并用鎳基顆粒隊(duì)蛋白粗提物進(jìn)行部分純化。方法將全長HBV-Pol基因用PCR方法擴(kuò)增并連接到在釀酒酵母高效表達(dá)的質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)化株于30℃培養(yǎng)3d后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)16h，4℃下收集蛋白粗提物并用鎳基顆粒進(jìn)行提純。用免疫印跡技術(shù)檢測表達(dá)結(jié)果。結(jié)果重組的HBV-Pol存在于該型酵母的蛋白粗提物中，該蛋白產(chǎn)物可被Nickel-particle提取。結(jié)論本研究為實(shí)現(xiàn)HBV-Pol在中的高水平表達(dá)提供了可靠依據(jù)，也便于HBV-Pol的生化特性研究以及蛋白純化和抗體制備的進(jìn)一步開展。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒;聚合酶;釀酒酵母

Abstract:ObjectiveAttempttoexpressHBV-Polinyeastexpressionsystemandthenpartiallypurifytheroughextractwithnickel-basedparticle.MethodsFulllengthHBV-PolgenewasamplifiedandwasintroducedintoahigheffectiveexpressionplasmidofSaccharomycescerevisiae.Thetransformantwasculturedat30℃for3days,andtheninductionwascarriedoutforanother16hoursat30℃,andtheninductionwascarriedoutforanother16hoursat30℃.Celllysisandpurificationwerepreformedat4℃.Targetproteinwasdetectedinharvestedroughextractwithwesternblot.ResultsTherecombinantHBV-Polwaspresentinroughextractofyeastandcouldbepurifiedwithnickelparticle.ConclusionsResultsofthisstudyprovethatHBV-Polcanbeexpressedinyeastandmightfacilitatethebiochemicalstudy,proteinpurificationandantibodypreparationofHBV-Pol.

Keywords：hepatitisBvirus;polymerase;Saccharomycescerevisiae

乙型肝炎病毒感染是全球性公眾健康問題。目前世界上約有億乙肝病毒攜帶者，其中很大比例將會發(fā)展成嚴(yán)重的肝臟疾病例如肝硬化、肝細(xì)胞癌及其它綜合征［1］。

乙肝病毒染色體僅有3200個左右的堿基對，屬于hepadnaviridae家族，有極強(qiáng)的肝細(xì)胞靶向性［2］。在乙肝病毒生命周期很重要的一步就是它利用自身編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行將其染色體復(fù)制。乙肝病毒聚合酶蛋白是一種多功能酶，具有蛋白始動活性［3-5］、DNA聚合酶活性、反轉(zhuǎn)錄酶活性［6］及RNA酶H活性［7］。它包括了三個結(jié)構(gòu)域，從氨基末端到羰基末端依次是末端蛋白，聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶及RNA酶H。其中末端蛋白與其它兩個域間由一空白序列隔開。

盡管HBV-Pol在其生命周期中起到至關(guān)重要的作用，但是由于HBV-Pol在異源性表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平低［8］、可溶狀態(tài)下極不穩(wěn)定［9］，協(xié)同表達(dá)的分子伴侶對該酶的潛在影響［10］等原因，關(guān)于該酶的生化研究仍然進(jìn)展緩慢。Kim等人在協(xié)同表達(dá)的GRP94的情況下，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)出麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)記的HBV-Pol，并證明其對乙肝病毒的εRNA有優(yōu)先結(jié)合的特征［11］。Qadri和Siddiqui［6］在釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)中利用基于Ty1-his3AI逆轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)并得到了部分純化的HBV-Pol，該HBV-Pol在一種病毒類似顆粒中可以將Ty1RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。然而穩(wěn)定的、不需要分子伴侶協(xié)同的大規(guī)模地在常用異源性表達(dá)系統(tǒng)中得到完整的HBV-Pol的方法目前仍未見報(bào)道。

酵母表達(dá)系統(tǒng)在重組蛋白表達(dá)研究中得到非常廣泛的應(yīng)用，其中釀酒酵母又是最常用的酵母菌株，本研究中，6聚體組氨酸標(biāo)記的全長HBV-Pol在中進(jìn)行表達(dá)并用鎳基顆粒進(jìn)行部分純化。免疫印跡的結(jié)果提示在酵母體內(nèi)表達(dá)人HBV-Pol是一種可靠地進(jìn)行大規(guī)模HBV-Pol制備方法，該方法可能會對該蛋白的生化特性研究和純化，以及特異性抗體的研究提供便利條件。

1材料與方法

酶與試劑

質(zhì)粒和V5抗體購買自Invitrogen(US)；MagneHis蛋白純化試劑盒購自Promega(US)；PrimeSTARTM高保真DNA聚合酶購自TAKARA株式會社(Japan);T4連接酶及限制性內(nèi)切酶購自NewEnglandBiolabs.DNA質(zhì)粒純化試劑盒購自Qiagen(Chatsworth,CA).Saccharomycescerevisiae菌株(基因型：MATαSUC2malmelgal2CUP1flo1flo8-1)購自ATCC公司。其它藥品均購自Sigma公司。

質(zhì)粒構(gòu)建

從已經(jīng)發(fā)展成肝細(xì)胞癌的慢性乙肝患者部分肝臟切除術(shù)后得到少許肝臟組織，切成小塊后迅速放入液氮保存。十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate，SDS)蛋白酶K消化后采用酚-氯仿提取法得細(xì)胞DNA［12］。HBV-PolDNA序列［從第2307到1623堿基對，共843個氨基酸殘基］(GenBank序列號AF286594)由PrimeSTARTM高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為CPNotIF01:GTTGCGGCCGCATAATGGCCCTATCTTATCandCPBstBIR01:ATTTTCGAATTCTCACGGTGGTTTCCA.構(gòu)建方法見圖1。于楊，等：人乙型肝炎病毒聚合酶在釀酒酵母中的表達(dá)遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2008年10月，29(5)圖1結(jié)構(gòu)如圖所示。全長HBV-Pol序列在酶切位點(diǎn)NotI和BstBI間連入，。V5抗原和多聚賴氨酸尾位于HBV-Pol3‘—末端。質(zhì)粒表達(dá)受控于Gal啟動子，預(yù)計(jì)融合蛋白約為96kD

酵母轉(zhuǎn)化株篩選

參照試劑盒說明書將純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)酵母。轉(zhuǎn)化株用SC-U(缺少脲嘧啶的最低培養(yǎng)基)選擇性平板培養(yǎng)基{%酵母氮基,2%碳基,%(腺嘌呤,精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸,色氨酸),%(天冬氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、纈氨酸)2%瓊脂}進(jìn)行篩選。

轉(zhuǎn)化株誘導(dǎo)

從SC-U平板培養(yǎng)基上挑取一個轉(zhuǎn)化株菌落并接種在含有2%的棉子糖或2%葡萄糖15mL選擇性培養(yǎng)液中(與SC-Uplate成分基本相同，僅缺少脲嘧啶和瓊脂)。30°C于搖床內(nèi)培養(yǎng)3d后測定培養(yǎng)液的OD600數(shù)值。更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液(與選擇性培養(yǎng)液成份基本相同,碳源為2%的半乳糖和2%棉子糖)。將得到的酵母細(xì)胞用誘導(dǎo)培養(yǎng)液重懸至OD600=，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)14～16h后,1500g離心收獲細(xì)胞待用。斑點(diǎn)雜交檢測誘導(dǎo)效果。

細(xì)胞裂解與蛋白純化

酵母細(xì)胞用裂解緩沖液懸浮(50mM磷酸鈉,pH;5%甘油;1mMPMSF)。等體積酸洗玻璃珠加入裂解液中后，混合物在漩渦混勻器上震蕩30s,緊接著冰上孵育30s。4min內(nèi)將上述步驟重復(fù)4次?？偭呀庖号cMagneHis鎳基顆?；靹?～10min。經(jīng)過MagneHis洗滌緩沖液兩次清洗后，用MagneHis洗脫緩沖液將目的蛋白洗脫?？偭呀庖?、流出液組分及部分純化組分分別用免疫印跡法檢測裂解與純化效果。

2結(jié)果

本研究中，HBV-Pol基因由從2307to1623的HBVDNA所編碼，具有843個氨基酸殘基。表達(dá)產(chǎn)物用免疫印跡法檢測。

酵母系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)與優(yōu)化

相對于其它微生物，Saccharomycescerevisiae早已為人熟知的遺傳學(xué)特性使得它成為最常用于重組蛋白表達(dá)的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)之一。本試驗(yàn)中，重組HBV-Pol的表達(dá)遵循了兩個策略：一是采用羧基端的6聚組氨酸標(biāo)記，便于目的蛋白的快速純化。二是將V5抗原(Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr)融入羧基端的重組蛋白中，便于采用V5特異性抗體來檢測表達(dá)效率。

本試驗(yàn)采用了斑點(diǎn)雜交來確定HBV-Pol表達(dá)條件優(yōu)化。同時也嘗試了一些公認(rèn)較好Saccharomycescerevisiae誘導(dǎo)優(yōu)化策略并進(jìn)行一些改進(jìn)。首先，用較長的培養(yǎng)時間來代替較短的過夜培養(yǎng)來獲得較高的細(xì)胞密度；其次，預(yù)試結(jié)果表明相同容器內(nèi)較小體積的培養(yǎng)效果要優(yōu)于同條件下正常體積培養(yǎng)液中的培養(yǎng)；最后，采用較大的容器，其更大的液體表面可以使搖動培養(yǎng)中的細(xì)胞獲得

長期以來關(guān)于人HBV-Pol的研究一直存在很多困難，諸如該蛋白難于在異源性系統(tǒng)中表達(dá)及在天然狀態(tài)下純化等。盡管重組的人HBV-Pol已經(jīng)通過很多方式在不同系統(tǒng)里嘗試過表達(dá)和純化，純化出的有活性并可用于生化研究的HBV-Pol仍是難題。

人HBV-Pol是一種多功能的蛋白質(zhì)，在異源性表達(dá)系統(tǒng)和在純化過程中極不穩(wěn)定［9］。但在本研究中，盡管沒有協(xié)同表達(dá)分子伴侶，仍然有一小部分完整的HBV-Pol存在于誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化株的總裂解液中。這部分目的蛋白可以通過鎳基親和層析的方法進(jìn)行純化。免疫印跡的結(jié)果比較提示這種鎳基顆粒可能適用于大規(guī)模的人HBV-Pol純化。

本研究結(jié)果也證明較短的純化時間是獲得完整人HBV-Pol的另一個重要因素。根據(jù)之前試驗(yàn)的結(jié)果，鎳基質(zhì)柱層析純化很難得到免疫印跡法可以探測水平的蛋白。鑒于柱層析的時間較長，步驟繁瑣，本試驗(yàn)采用了鎳基顆粒的方式來進(jìn)行純化。

人HBV-Pol對于乙肝病毒的染色體復(fù)制至關(guān)重要。目前美國FDA通過的6種治療慢性乙型肝炎的藥物中，lamivudine,adefovirdipivoxil,entecavir和telbivudine都是HBV-Pol的抑制劑［13］。因此對于該蛋白的研究將會有利于

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