依托昔布對大鼠單側(cè)輸尿管梗阻腎臟病變的影響

依托昔布對大鼠單側(cè)輸尿管梗阻腎臟病變的影響【摘要】目的：觀察選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑依托昔布對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟病變的影響.方法：將大鼠隨機分為單側(cè)輸尿管梗阻組，依托昔布治療組和對照組進行實驗，測定血肌酐、尿素氮和腎皮質(zhì)NO含量，并用免疫組化法半定量測定腎組織TGFβ1和COX2的表達水平.結(jié)果：單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后3wk，單側(cè)輸尿管梗阻組和用藥組大鼠腎臟均可見明顯病理改變與纖維化，血肌酐［mL/min］、尿素氮［mmol/L］和腎皮質(zhì)NO含量［mmol/L］均比對照組［(±)mL/min,(±)mmol/L,mmol/L］顯著性升高，腎組織TGFβ1和COX2的表達水平顯著性上調(diào).用藥組與單側(cè)輸尿管梗阻組比較，病理改變與纖維化程度，血肌酐、尿素氮和腎皮質(zhì)NO含量、腎組織TGFβ1和COX2的表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義.結(jié)論：特異性COX2抑制劑依托昔布能減輕單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟病理損傷和纖維化改變.

【關(guān)鍵詞】輸尿管梗阻纖維化環(huán)氧化酶2依托昔布

0引言

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)包括COX1和COX2兩種同工酶，目前認(rèn)為是前列腺素代謝環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵性限速酶，COX1參與正常生理過程，而COX2可介導(dǎo)病理改變［1］.研究結(jié)果顯示，COX2大量生成在輸尿管梗阻所引發(fā)的腎小管間質(zhì)纖維化過程中起重要作用［2］，并發(fā)現(xiàn)COX2在腎皮質(zhì)的過度表達可能是腎內(nèi)炎性細胞浸潤和聚集的起始或促進因素之一.而臨床上用非甾體類抗炎藥(nonsteroidantiinflammatorydrugs,NSAIDs)治療腎臟炎性疾病引起不良反應(yīng)可能與NSAIDs在阻斷COX2催化的病理性前列腺素合成的同時，也阻斷了COX1催化的生理性前列腺素的合成有關(guān).為了探討通過選擇性地阻斷COX2的合成，避免NSAIDs的不良反應(yīng)的有效途徑［3］，我們用單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型［4］，觀察腎組織中COX2和TGFβ1的改變及其在輸尿管梗阻所致腎損傷的發(fā)生發(fā)展中的作用，并觀察選擇性COX2抑制劑依托昔布(Etoricoxib)對梗阻性腎病發(fā)生發(fā)展的影響及對腎臟的保護作用，為治療相關(guān)腎臟損傷提供基礎(chǔ).

1材料和方法

材料健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180~220g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境保持通風(fēng)，濕度55%，溫度22℃，晝夜燈光照明，定期消毒籠具.依托昔布由北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司提供.山羊抗大鼠COX2多克隆抗體、兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體為SantaCrutz公司產(chǎn)品.

方法

單側(cè)輸尿管梗阻模型動物平均分為對照組、單側(cè)輸尿管梗阻組和依托昔布治療組.對照組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其余步驟同其它兩組.治療組于術(shù)前24h開始給予依托昔布，每日10mg/kg溶于1mL生理鹽水中灌胃，梗阻組僅以等量生理鹽水灌胃.g/L水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉梗阻組和依托昔布治療組大鼠.于背部左側(cè)縱形切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露左側(cè)腎臟，分離輸尿管，分別在緊貼腎門處及遠端結(jié)扎輸尿管，于兩結(jié)扎處之間剪斷，逐層縫合肌肉、皮膚，以碘伏消毒.術(shù)后肌肉注射羅氏芬預(yù)防感染，每日mg/kg，連續(xù)3d.腎臟取材與保存：術(shù)后第3周，在采集血液標(biāo)本后，手術(shù)取出大鼠左腎，剝離腎包膜，將腎臟沿縱軸剖開，取適量皮質(zhì)組織作NO含量測定用，其余組織迅速保存在中性甲醛中以備組織學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色用.

血液生化指標(biāo)測定將術(shù)后第3周采集血液標(biāo)本離心，取血清，在全自動生化分析儀上測定血肌酐與尿素氮.

腎皮質(zhì)NO含量測定取約g左腎組織，加入4mL4℃生理鹽水中，用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制成勻漿，4℃，1000r/min，離心5min，取上清液-20℃保存待測.用硝酸還原酶法測定NO含量，按試劑盒檢測步驟，分別在空白管，標(biāo)準(zhǔn)管，測定管中滴加試劑，混勻，37℃水浴60min，再次滴加試劑，充分旋渦混勻30s，室溫靜置10min,4000r/min離心10min，取上清，分別加入顯色劑，混勻，室溫靜置10min，蒸餾水調(diào)零，550nm,cm光徑比色測定各管吸光度值，NO含量，4℃冰箱過夜，復(fù)溫,PBS浸洗.滴加生物素化抗兔或抗山羊二抗，室溫孵育.PBS液浸洗，再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶，室溫孵育.PBS液浸洗，顯色劑DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察.以正常兔或山羊血清代替一抗作陰性對照，免疫組化結(jié)果均為陰性.

結(jié)果判定腎小管間質(zhì)病變程度的判定按Priraini法評分.每例切片記錄連續(xù)不重疊的20個低倍視野的數(shù)值，取平均值.對TGFβ1和COX2的表達，根據(jù)著色范圍進行半定量分析.每例切片記錄20個連續(xù)不重疊的腎皮質(zhì)間質(zhì)高倍視野，取平均值.

統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS做統(tǒng)計分析，所用統(tǒng)計方法為方差分析，為檢驗水準(zhǔn).【摘要】目的：觀察選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑依托昔布對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟病變的影響.方法：將大鼠隨機分為單側(cè)輸尿管梗阻組，依托昔布治療組和對照組進行實驗，測定血肌酐、尿素氮和腎皮質(zhì)NO含量，并用免疫組化法半定量測定腎組織TGFβ1和COX2的表達水平.結(jié)果：單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后3wk，單側(cè)輸尿管梗阻組和用藥組大鼠腎臟均可見明顯病理改變與纖維化，血肌酐［mL/min］、尿素氮［mmol/L］和腎皮質(zhì)NO含量［mmol/L］均比對照組［(±)mL/min,(±)mmol/L,mmol/L］顯著性升高，腎組織TGFβ1和COX2的表達水平顯著性上調(diào).用藥組與單側(cè)輸尿管梗阻組比較，病理改變與纖維化程度，血肌酐、尿素氮和腎皮質(zhì)NO含量、腎組織TGFβ1和COX2的表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義.結(jié)論：特異性COX2抑制劑依托昔布能減輕單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟病理損傷和纖維化改變.

【關(guān)鍵詞】輸尿管梗阻纖維化環(huán)氧化酶2依托昔布

0引言

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)包括COX1和COX2兩種同工酶，目前認(rèn)為是前列腺素代謝環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵性限速酶，COX1參與正常生理過程，而COX2可介導(dǎo)病理改變［1］.研究結(jié)果顯示，COX2大量生成在輸尿管梗阻所引發(fā)的腎小管間質(zhì)纖維化過程中起重要作用［2］，并發(fā)現(xiàn)COX2在腎皮質(zhì)的過度表達可能是腎內(nèi)炎性細胞浸潤和聚集的起始或促進因素之一.而臨床上用非甾體類抗炎藥(nonsteroidantiinflammatorydrugs,NSAIDs)治療腎臟炎性疾病引起不良反應(yīng)可能與NSAIDs在阻斷COX2催化的病理性前列腺素合成的同時，也阻斷了COX1催化的生理性前列腺素的合成有關(guān).為了探討通過選擇性地阻斷COX2的合成，避免NSAIDs的不良反應(yīng)的有效途徑［3］，我們用單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型［4］，觀察腎組織中COX2和TGFβ1的改變及其在輸尿管梗阻所致腎損傷的發(fā)生發(fā)展中的作用，并觀察選擇性COX2抑制劑依托昔布(Etoricoxib)對梗阻性腎病發(fā)生發(fā)展的影響及對腎臟的保護作用，為治療相關(guān)腎臟損傷提供基礎(chǔ).

1材料和方法

材料健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180~220g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境保持通風(fēng)，濕度55%，溫度22℃，晝夜燈光照明，定期消毒籠具.依托昔布由北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司提供.山羊抗大鼠COX2多克隆抗體、兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體為SantaCrutz公司產(chǎn)品.

方法

單側(cè)輸尿管梗阻模型動物平均分為對照組、單側(cè)輸尿管梗阻組和依托昔布治療組.對照組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其余步驟同其它兩組.治療組于術(shù)前24h開始給予依托昔布，每日10mg/kg溶于1mL生理鹽水中灌胃，梗阻組僅以等量生理鹽水灌胃.g/L水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉梗阻組和依托昔布治療組大鼠.于背部左側(cè)縱形切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露左側(cè)腎臟，分離輸尿管，分別在緊貼腎門處及遠端結(jié)扎輸尿管，于兩結(jié)扎處之間剪斷，逐層縫合肌肉、皮膚，以碘伏消毒.術(shù)后肌肉注射羅氏芬預(yù)防感染，每日mg/kg，連續(xù)3d.腎臟取材與保存：術(shù)后第3周，在采集血液標(biāo)本后，手術(shù)取出大鼠左腎，剝離腎包膜，將腎臟沿縱軸剖開，取適量皮質(zhì)組織作NO含量測定用，其余組織迅速保存在中性甲醛中以備組織學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色用.

血液生化指標(biāo)測定將術(shù)后第3周采集血液標(biāo)本離心，取血清，在全自動生化分析儀上測定血肌酐與尿素氮.

腎皮質(zhì)NO含量測定取約g左腎組織，加入4mL4℃生理鹽水中，用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制成勻漿，4℃，1000r/min，離心5min，取上清液-20℃保存待測.用硝酸還原酶法測定NO含量，按試劑盒檢測步驟，分別在空白管，標(biāo)準(zhǔn)管，測定管中滴加試劑，混勻，37℃水浴60min，再次滴加試劑，充分旋渦混勻30s，室溫靜置10min,4000r/min離心10min，取上清，分別加入顯色劑，混勻，室溫靜置10min，蒸餾水調(diào)零，550nm,cm光徑比色測定各管吸光度值，NO含量，4℃冰箱過夜，復(fù)溫,PBS浸洗.滴加生物素化抗兔或抗山羊二抗，室溫孵育.PBS液浸洗，再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶，室溫孵育.PBS液浸洗，顯色劑DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下