大腸桿菌基因工程

大腸桿菌基因工程第一頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五基因工程課程內(nèi)容5

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基因工程概論分子克隆單元操作大腸桿菌基因工程酵母基因工程動(dòng)物基因工程植物基因工程基因工程進(jìn)展第二頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五回顧：基因工程的基本目的是什么？1、獲取、整理遺傳信息資源：破解生命之謎、利用基因資源2、生產(chǎn)功能蛋白或化學(xué)原料研究用途：基因功能研究，工具酶、免疫分析用抗原/抗體醫(yī)藥用途：蛋白/多肽藥物、抗原（疫苗）、抗體（治療/診斷）、免疫毒素等。

工業(yè)用途：工業(yè)用酶、工業(yè)原料3、改良生物性狀：分子育種（改良/創(chuàng)造）、基因治療/免疫

第三頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五問(wèn)題：如何利用基因資源？克隆目的基因轉(zhuǎn)入特定宿主表達(dá)目的基因生產(chǎn)蛋白/多肽：強(qiáng)調(diào)高效分子育種/基因治療/免疫：強(qiáng)調(diào)可控全基因：基因文庫(kù)/PCR編碼序列：cDNA文庫(kù)/RT-PCR/合成選擇宿主（特點(diǎn)、優(yōu)缺點(diǎn)？）構(gòu)建表達(dá)載體（關(guān)鍵元件、調(diào)控原理？）轉(zhuǎn)基因（轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、導(dǎo)入方法？）第四頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五基因工程主要宿主系統(tǒng)

原核細(xì)胞(Prokaryotic)真菌（Fungus)

昆蟲(chóng)(Baculovirus)

高等真核細(xì)胞（Eukaryotic)人（基因治療）動(dòng)、植物（基因農(nóng)場(chǎng)）第五頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五主要的蛋白質(zhì)生產(chǎn)宿主系統(tǒng)I原核：大腸桿菌Escherichiacoli*****

枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis**

II低等真核：釀酒酵母Saccharomycescerevisiae

畢赤酵母Pichiapastoris***漢森酵母Hansenulapolymopha**

黑曲霉菌Aspergillusniger**

III高等真核：

中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞（CHO）***

昆蟲(chóng)細(xì)胞——桿狀病毒**重點(diǎn)：各自優(yōu)缺點(diǎn)是什么？第六頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五表達(dá)載體的基本條件（關(guān)鍵元件）1、高效的、可調(diào)控的表達(dá)元件

1）轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后水平：DNAmRNA原核：?jiǎn)?dòng)子、終止子真核：?jiǎn)?dòng)子、終止子、增強(qiáng)子、PolyA位點(diǎn)、內(nèi)含子2）

翻譯水平原核：核糖體結(jié)合位點(diǎn)（如SD序列）真核：5’-端非翻譯區(qū)（5’-UTR）3)翻譯后水平:信號(hào)肽重點(diǎn)：各宿主系統(tǒng)表達(dá)載體的關(guān)鍵元件、調(diào)控原理與優(yōu)化策略？第七頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五表達(dá)載體的基本條件（關(guān)鍵元件）

3、便于篩選大腸桿菌中的篩選標(biāo)記（表達(dá)載體構(gòu)建）

最終宿主系統(tǒng)的篩選標(biāo)記（轉(zhuǎn)基因宿主篩選）4、便于目的基因亞克隆：多克隆位點(diǎn)2、高拷貝數(shù)與遺傳穩(wěn)定

自主復(fù)制（高拷貝、不穩(wěn)定）

整合（低拷貝、穩(wěn)定）第八頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五典型的原核表達(dá)載體第九頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五典型的原核表達(dá)載體第十頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五典型的真核表達(dá)載體第十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五第三章大腸桿菌基因工程Escherichiacoli

（SEM，×14000）

第十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化三、工程菌構(gòu)建策略二、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)原理一、大腸桿菌表達(dá)（生產(chǎn)）系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)五、利用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白案例第三章大腸桿菌基因工程第十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)第十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的差別第十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五生長(zhǎng)速度驚人的大腸桿菌第十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五遺傳背景清楚（4405個(gè)ORF），便于基因操作表達(dá)水平高，遺傳較穩(wěn)定

優(yōu)良的工業(yè)性能：繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、被美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的重組藥物生產(chǎn)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)第十七頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五胞內(nèi)缺乏高效的表達(dá)產(chǎn)物折疊機(jī)制（形成包涵體），分泌機(jī)制不完善缺乏翻譯后修飾加工系統(tǒng)（不能表達(dá)糖基化蛋白、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白等）細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)第十八頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五

初次嘗試掃盲亂棍打棗入門系統(tǒng)優(yōu)化中級(jí)自成一體高手成功的實(shí)驗(yàn)都是一樣的，失敗的實(shí)驗(yàn)各有各的不幸第十九頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá)原理啟動(dòng)子（轉(zhuǎn)錄）終止子（轉(zhuǎn)錄）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（翻譯）密碼子（翻譯）質(zhì)?？截悢?shù)（轉(zhuǎn)錄）第二十頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)載體的基本元件A、目的基因：編碼外源蛋白的結(jié)構(gòu)基因B、轉(zhuǎn)錄元件：?jiǎn)?dòng)子、終止子C、翻譯元件：核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)D、克隆元件：克隆位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因E、翻譯后元件（非必須）：信號(hào)肽、融合肽第二十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)載體的物理圖譜第二十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五1、啟動(dòng)子與外源基因表達(dá)

*是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始RNA合成的序列。*是基因表達(dá)最關(guān)鍵調(diào)控元件（沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄）。*啟動(dòng)子有種屬特異性（如真核的在原核宿主中無(wú)效）*有組成型和誘導(dǎo)型二大類啟動(dòng)子(Promoter)第二十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五組成型與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子*無(wú)需誘導(dǎo)*整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程一直不停地表達(dá)目的蛋白*一般采用基礎(chǔ)代謝關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子*不適合表達(dá)一些對(duì)宿主細(xì)菌生長(zhǎng)有害的蛋白產(chǎn)物*表達(dá)量通常不高：過(guò)量或者有害表達(dá)影響細(xì)菌生長(zhǎng)組成型表達(dá)系統(tǒng)第二十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五組成型與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子*只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物*使生長(zhǎng)相與表達(dá)相分開(kāi)，避免表達(dá)與生長(zhǎng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和對(duì)菌體的毒害*可減少菌體蛋白酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解*特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)*啟動(dòng)子是組成型的，但是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)第二十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五原核基因啟動(dòng)子原核生物啟動(dòng)子是由兩段彼此分開(kāi)且又高度保守的核苷酸序列組成：

（1）Pribnow盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5—10bp，一般由6～8個(gè)堿基組成，富含A和T，故又稱為TATA盒或—10區(qū)。

（2）—35區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35bp處，故稱—35區(qū)，一般由10個(gè)堿基組成。第二十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五啟動(dòng)子保守序列-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動(dòng)子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac

=

3

Ptrp

=

11

PlacPtac

=

3

Ptrp

=

11

Plac第二十七頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五啟動(dòng)子的篩選AprorigalKpKO1終止子采用鳥(niǎo)槍法策略，將合適大小的DNA片段克隆到啟動(dòng)子探針質(zhì)粒pKO1上宿主細(xì)胞染色體DNA上的galE、galT與質(zhì)粒上報(bào)告基因galk的表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株含有外源啟動(dòng)子活性的重組克隆第二十八頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五常用原核基因啟動(dòng)子

lac(乳糖啟動(dòng)子)trp(色氨酸啟動(dòng)子)tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子PL和PR(λ噬菌體的左向和右向啟動(dòng)子)T7啟動(dòng)子第二十九頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五啟動(dòng)子P乳糖啟動(dòng)子（Plac）負(fù)調(diào)控（lacI）：OPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高第三十頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五P乳糖啟動(dòng)子PlacOPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高lacI負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控第三十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五P乳糖啟動(dòng)子PlacOPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控lacI負(fù)調(diào)控第三十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五P乳糖啟動(dòng)子PlacOPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基高水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控lacI負(fù)調(diào)控第三十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五P乳糖啟動(dòng)子PlacO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控lacI負(fù)調(diào)控第三十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五問(wèn)題1：葡萄糖是宿主最適碳源，而啟動(dòng)子受葡萄糖阻遏，不便于發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

對(duì)策：采用突變型PlacUV5（不受葡萄糖阻遏）Plac

-lacI調(diào)控模式的問(wèn)題與策略第三十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五PlacCAP正調(diào)控OPlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝野生型的Plac上游附近擁有代謝激活蛋白（CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP基底水平轉(zhuǎn)錄結(jié)合啟動(dòng)子控制區(qū)，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAMP減少，也能阻遏Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。因此，可采用突變手段構(gòu)建抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄突變型乳糖啟動(dòng)子PlacUV5第三十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五問(wèn)題2乳糖容易被宿主菌利用和降解，不宜作為誘導(dǎo)劑對(duì)策采用“安慰誘導(dǎo)劑”IPTG（不被降解和代謝）Plac

-lacI調(diào)控模式的問(wèn)題與策略IPTG：異丙基D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside)第三十七頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五問(wèn)題3：宿主lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，無(wú)法滿足多拷貝質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致較高的本底表達(dá)（即無(wú)誘導(dǎo)表達(dá)）

對(duì)策

A、采用能過(guò)量表達(dá)lacI阻遏蛋白的lacIq

突變菌株

B、在

載體上引入lacIq

基因Plac

-lacI調(diào)控模式的問(wèn)題與策略第三十八頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五啟動(dòng)子Ptrp色氨酸啟動(dòng)子（Ptrp）Otrp除去色氨酸色氨酸啟動(dòng)子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸基底水平轉(zhuǎn)錄或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目基因的表達(dá)色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白（IAA）OtrpPtrp高效轉(zhuǎn)錄OtrpPtrp第三十九頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五受lacI阻遏蛋白調(diào)控雜合型啟動(dòng)子PtacPtac=

Ptrp

的-35區(qū)+

Plac的-10區(qū)Ptac

=

3

Ptrp

=

11

Plac（TTGACA）（TATAAT）受什么誘導(dǎo)？第四十頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五l噬菌體啟動(dòng)子PL/PR受CI阻遏蛋白阻遏CI為組成型表達(dá)常采用溫度敏感型突變cI857cI857阻遏蛋在42℃時(shí)失活脫落，PL便可介導(dǎo)目的基因的表達(dá)實(shí)踐中，28-37℃培養(yǎng)，42℃誘導(dǎo)。30℃/37℃？第四十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五發(fā)酵罐中大規(guī)模升溫困難如何解決？常使Ptrp控制的CI用一個(gè)雙質(zhì)?？刂葡到y(tǒng)，用色氨酸間接控制目的基因表達(dá)（不是加3-吲哚丙烯酸，IAA）。PtrpABcI857PL目的基因阻遏作用PtrpABPL表達(dá)色氨酸第四十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五T7啟動(dòng)子——來(lái)自T7噬菌體的異源啟動(dòng)子第四十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五T7啟動(dòng)子——最成功的啟動(dòng)子

*只有T7RNA聚合酶才能識(shí)別T7啟動(dòng)子*T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶的快5倍*由于大腸桿菌本身不含T7RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌。*通過(guò)調(diào)控T7RNA聚合酶的表達(dá)間接調(diào)控外源基因的表達(dá)*以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。第四十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五T7啟動(dòng)子調(diào)控模式

IPTG誘導(dǎo)T7RNA聚合酶表達(dá)噬菌體DE3（lambda噬菌體的衍生株）含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動(dòng)子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac一樣都是IPTG誘導(dǎo)。第四十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五T7啟動(dòng)子調(diào)控模式

2.熱誘導(dǎo)T7RNA聚合酶用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，用λCE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞——CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動(dòng)子控制T7RNA聚合酶的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7RNA聚合酶的合成。第四十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五T7啟動(dòng)子調(diào)控模式

3.溶氧誘導(dǎo)T7RNA聚合酶通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提供T7RNA聚合酶。用受溶氧濃度控制的啟動(dòng)子調(diào)控T7RNA聚合酶合成，以適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。第四十七頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五T7啟動(dòng)子調(diào)控模式

4.抑制本底表達(dá)方法

1）培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制本底表達(dá)水平。2)向宿主細(xì)胞引入T7融菌酶質(zhì)粒（pLysS），結(jié)合并抑制T7RNA聚合酶的基因。第四十八頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、終止子外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；干擾質(zhì)粒的復(fù)制及抗性，導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗；不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象：RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物。第四十九頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五防止轉(zhuǎn)錄過(guò)頭策略

大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2T7噬菌體DNA上的TfA、采用強(qiáng)終止子B、二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)第五十頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五終止子強(qiáng)終止子的選擇與使用

目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子也可以象啟動(dòng)子那樣，通過(guò)特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選pCP1AproriTcr篩選Apr、Tcs的轉(zhuǎn)化子第五十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）:

mRNA5’

端非翻譯序列,包括SD、起始密碼子、SD與起始密碼子間的序列、起始密碼子下游序列。

商品化大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒均含有與啟動(dòng)子來(lái)源相同的RBS，序列和間隔是最佳的

第五十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列（Shine-Dalgarno）：

位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列（5’UAAGGAGG3’），它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯。第五十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列與起始密碼子之間的距離的影響：

SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。

在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低第五十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列與起始密碼子之間的序列的影響：

SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響，對(duì)于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個(gè)位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低20倍第五十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五核糖體結(jié)合位點(diǎn)翻譯起始密碼子及其下游序列大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子。

起始效率差異：GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。從AUG開(kāi)始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。

第五十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，編輯于2023年，星期五4、質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒拷貝數(shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的克隆用質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過(guò)度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降

策略：較低拷貝質(zhì)粒（幾個(gè)至數(shù)十個(gè)）

調(diào)控重