拉曼光譜技術(shù)在植物細(xì)胞壁中的應(yīng)用以及展望演示文稿

拉曼光譜技術(shù)在植物細(xì)胞壁中的應(yīng)用以及展望演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)拉曼光譜技術(shù)在植物細(xì)胞壁中的應(yīng)用以及展望當(dāng)前第2頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)截至2010年，全世界石油儲(chǔ)藏量為13830億桶，日消耗量為8740萬(wàn)桶；天然氣儲(chǔ)量為187.1萬(wàn)億立方米，年消耗量為3.1萬(wàn)億立方米；煤炭?jī)?chǔ)量為8600億噸，年消耗量為72.7億噸（statisticalreviewofworldenergyfullreport2011）。不斷增加的能源消耗量使石油，天然氣和煤炭資源在最多43年，62年和120年后將枯竭。世界靠科技、工具與能源來(lái)改變，工業(yè)革命、科技革命和信息革命都改變了世界格局，當(dāng)今的世界格局是西方掌握的先進(jìn)科技與發(fā)達(dá)信息以及石油、天然氣的分布劃分而成的。而下一場(chǎng)能源革命已經(jīng)悄悄在美國(guó)和加拿大展開(kāi)……頁(yè)巖氣！美國(guó)已經(jīng)擁有了生產(chǎn)頁(yè)巖氣的技術(shù)與批量生產(chǎn)的能力，五年之后就將生產(chǎn)出足以替代石油的新型清潔能源，加上美國(guó)國(guó)內(nèi)的石油與天然氣開(kāi)發(fā)也逐步啟動(dòng)，二戰(zhàn)后按石油儲(chǔ)藏與生產(chǎn)、使用來(lái)劃分的世界格局即將破局，中東的地位大幅下降，甚至?xí)S為一個(gè)亂攤子；俄羅斯靠出口石油的經(jīng)濟(jì)將會(huì)一蹶不振?；ヂ?lián)網(wǎng)大數(shù)據(jù)時(shí)代讓世界從此沒(méi)有孤島，能源革命直接決定世界的未來(lái)！僅僅是頁(yè)巖氣革命么？不！核能不可再生而且存在風(fēng)險(xiǎn)，太陽(yáng)能，風(fēng)能，地?zé)崮埽绕涫恰镔|(zhì)能植物利用太陽(yáng)能，通過(guò)碳同化的過(guò)程將吸收的二氧化碳轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)物，儲(chǔ)存于植物體內(nèi)。生物質(zhì)能的形成過(guò)程由植物體自身完成，同時(shí)消耗掉大氣中的二氧化碳，維持大氣平衡。同時(shí)全世界范圍內(nèi)生物質(zhì)資源總量十分豐富。木材是人們利用生物質(zhì)能源的主要形式。木材即植物的次生木質(zhì)部，它由木本植物的一種側(cè)生分生組織—維管形成層活動(dòng)而產(chǎn)生，因此對(duì)維管形成層發(fā)育與遺傳調(diào)控的研究是使人們了解木材形成，提高木材產(chǎn)量和利用率的基礎(chǔ)。當(dāng)前第3頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)要解決的問(wèn)題……木材形成與形成層的活動(dòng)緊密相連木材的次生木質(zhì)部是形成層細(xì)胞分裂形成的,形成層在活動(dòng)期內(nèi)的活動(dòng)變化不僅影響著木質(zhì)部細(xì)胞形成的數(shù)量,同時(shí)決定著木材的構(gòu)造和其物理化學(xué)性能。形成層紡錘形細(xì)胞是如何分化出各種類型樣式的木質(zhì)部細(xì)胞?分化出來(lái)的木質(zhì)部細(xì)胞是怎么生長(zhǎng)的,其在發(fā)育過(guò)程中會(huì)發(fā)生什么的變化?而這些變化又與什么因素有關(guān)?從細(xì)胞生物學(xué)和解剖形態(tài)學(xué)的水平來(lái)看，木材生長(zhǎng)發(fā)育形成過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了哪些變化？在細(xì)胞水平和組織水平上來(lái)說(shuō)，木材生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生了哪些細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)和化學(xué)成分分布的變化？這些問(wèn)題,對(duì)于實(shí)現(xiàn)木材性質(zhì)的改良和定向培育提供重要的理論依據(jù)。當(dāng)前第4頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)1.1木質(zhì)部細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)胞間層(intercellularlayer)細(xì)胞胞間層(intercellularlayer)在分裂時(shí)，最初形成的一層是由果膠質(zhì)組成的細(xì)胞板(cellplate)，它把兩個(gè)子細(xì)胞分開(kāi)，這層就是胞間層，又稱中層(middlelamella)。初生壁(primarywall)隨著子細(xì)胞的生長(zhǎng)，原生質(zhì)向外分泌纖維素，纖維素定向地交織成網(wǎng)狀，而后分泌的半纖維素、果膠以及結(jié)構(gòu)蛋白填充在網(wǎng)眼之間，形成質(zhì)地柔軟的初生壁。次生壁(secondarywall)很多細(xì)胞只有初生壁，如分生組織細(xì)胞、胚乳細(xì)胞等。但是，某些特化的細(xì)胞，例如纖維細(xì)胞、管胞、導(dǎo)管等在生長(zhǎng)接近定型時(shí)，在初生壁內(nèi)側(cè)沉積纖維素、木質(zhì)素等次生壁物質(zhì)，且層與層之間經(jīng)緯交錯(cuò)。由于次生壁質(zhì)地的厚薄與形狀的差別，分化出不同的細(xì)胞，如薄壁細(xì)胞、厚壁細(xì)胞、石細(xì)胞等.形成層細(xì)胞分化為未成熟木質(zhì)部細(xì)胞，未成熟木質(zhì)部細(xì)胞繼續(xù)分化。其中包括細(xì)胞壁沉積的重要過(guò)程當(dāng)前第5頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)ML胞間層；CW1初生壁；S1次生壁外層；S2次生壁中層；S3次生壁內(nèi)層當(dāng)前第6頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)構(gòu)成細(xì)胞壁的成分中，多糖，蛋白質(zhì)、酶類以及脂肪酸等細(xì)胞壁中的多糖主要是纖維素、半纖維素和果膠類纖維素構(gòu)成微團(tuán)，微團(tuán)組成微纖絲，微纖絲再組成大纖絲，構(gòu)成細(xì)胞壁支架次生細(xì)胞壁中還有大量木質(zhì)素1.2細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分當(dāng)前第7頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)1.3細(xì)胞壁形成細(xì)胞壁的形成是多種細(xì)胞器配合作用的結(jié)果。新細(xì)胞壁的形成開(kāi)始于細(xì)胞分裂的晚后期或早期。細(xì)胞分裂時(shí)，在母細(xì)胞的赤道板面上，分泌囊泡(secretoryvesicles)不規(guī)則地匯聚在一塊，逐漸整齊地排列成片，組成成膜體(phragmoplast)。成膜體中的囊泡膜相互融合與連接形成細(xì)胞的質(zhì)膜，其中的內(nèi)含物連成一體構(gòu)成細(xì)胞板，這是雛形的中層結(jié)構(gòu)。細(xì)胞板組成后，高爾基體小泡運(yùn)輸造壁物質(zhì)釋放到質(zhì)膜外，以充實(shí)新形成的壁。當(dāng)細(xì)胞板中逐漸有果膠質(zhì)和少量纖維素分子不斷地填充和摻入時(shí)便構(gòu)成了中層，在中層兩側(cè)陸續(xù)有纖維素和半纖維素等物質(zhì)的沉積則形成了質(zhì)地柔軟的初生壁，這時(shí)兩個(gè)子細(xì)胞便形成。此后，大多數(shù)細(xì)胞的初生壁內(nèi)側(cè)又分層、定向地沉積著纖維素分子，它們經(jīng)緯分明地交叉加固，這是增強(qiáng)植物體支持能力的重要基礎(chǔ)。纖維素分子的定向分層沉積與微管的活動(dòng)有關(guān)，秋水仙素(colchicine)可阻止微管的形成，抑制纖維素分子的定向排列。微管的另一個(gè)重要作用是使新形成的細(xì)胞板上保留某些通道，參與胞間連絲的形成，使原生質(zhì)在兩個(gè)子細(xì)胞間能保持聯(lián)系。當(dāng)前第8頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)1.4胞間連絲當(dāng)細(xì)胞板尚未完全形成時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的片段或分支，以及部分的原生質(zhì)絲(約400nm)留在未完全合并的成膜體中的小囊泡之間，以后便成為兩個(gè)子細(xì)胞的管狀聯(lián)絡(luò)孔道，這種穿越細(xì)胞壁、連接相鄰細(xì)胞原生質(zhì)(體)的管狀通道被稱為胞間連絲(plasmodesma)。胞間連絲的數(shù)量和分布與細(xì)胞的類型，所處的相對(duì)位置和細(xì)胞的生理功能密切相關(guān)。胞間連絲的功能：物質(zhì)交換&信號(hào)傳遞當(dāng)前第9頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)1.5細(xì)胞壁的功能對(duì)于細(xì)胞壁的功能，目前較肯定的有以下幾個(gè)方面：維持細(xì)胞形狀，控制細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞壁增加了細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，并承受著內(nèi)部原生質(zhì)體由于液泡吸水而產(chǎn)生的膨壓，從而使細(xì)胞具有一定的形狀，這不僅有保護(hù)原生質(zhì)體的作用，而且維持了器官與植株的固有形態(tài)。另外，細(xì)胞壁控制著細(xì)胞的生長(zhǎng)，因?yàn)榧?xì)胞要擴(kuò)大和伸長(zhǎng)的前提是要使細(xì)胞壁松馳和不可逆伸展。物質(zhì)運(yùn)輸與信息傳遞細(xì)胞壁允許離子、多糖等小分子和低分子量的蛋白質(zhì)通過(guò)，而將大分子或微生物等阻于其外。因此，細(xì)胞壁參與了物質(zhì)運(yùn)輸、降低蒸騰作用、防止水分損失(次生壁、表面的蠟質(zhì)等)、植物水勢(shì)調(diào)節(jié)等一系列生理活動(dòng)。細(xì)胞壁上紋孔或胞間連絲的大小受細(xì)胞生理年齡和代謝活動(dòng)強(qiáng)弱的影響，故細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸具有調(diào)節(jié)作用。另外，細(xì)胞壁也是化學(xué)信號(hào)(激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等)、物理信號(hào)(電波、壓力等)傳遞的介質(zhì)與通路。防御與抗性細(xì)胞壁中一些寡糖片段能誘導(dǎo)植保素（phytoalexin）的形成，它們還對(duì)其它生理過(guò)程有調(diào)節(jié)作用，這種具有調(diào)節(jié)活性的寡糖片斷稱為寡糖素(oligosaccharin)。當(dāng)前第10頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)光譜分類發(fā)射光譜原子發(fā)射光譜（AES）、原子熒光光譜（AFS）、X射線熒光光譜法（XFS）、分子熒光光譜法（MFS）等吸收光譜紫外－可見(jiàn)光法（UV-Vis）、原子吸收光譜（AAS）、紅外觀光譜（IR）、核磁共振（NMR）等聯(lián)合散射光譜拉曼散射光譜（Raman）2拉曼光譜技術(shù)

當(dāng)前第11頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)1923年，德國(guó)物理學(xué)家A.Smekal從理論上預(yù)言了光的非彈性散射的存在。（A.Smekal，Nature11(1923)873）

1928年，印度物理學(xué)家C.V.Raman在用汞燈的單色光來(lái)照射CCl4液體時(shí)，在液體的散射光中觀測(cè)到了頻率低于入射光頻率的新譜線。在拉曼等人宣布了他們的發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)月后，蘇聯(lián)物理學(xué)家蘭德斯別爾格等也獨(dú)立地報(bào)道了晶體中的這種效應(yīng)的存在。（C.V.Raman,K.S.Krishman,Nature121(1928)501）

光照射到物質(zhì)上時(shí)會(huì)發(fā)生非彈性散射，散射光中除有與激發(fā)光波長(zhǎng)相同的彈性成分（瑞利散射）外，還有比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)的和短的成分，后一現(xiàn)象統(tǒng)稱為拉曼（Raman）效應(yīng)。2.1拉曼散射效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)當(dāng)前第12頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)從理論到技術(shù)—拉曼散射效應(yīng)的進(jìn)展1928年，印度物理學(xué)家拉曼（C.V.Raman）首次發(fā)現(xiàn)拉曼散射效應(yīng)，榮獲1930年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)，拉曼也成為自然科學(xué)亞洲諾獎(jiǎng)第一人。1928-1940年，拉曼光譜成為研究分子結(jié)構(gòu)的主要手段。因?yàn)槔庾V頻率及強(qiáng)度、偏振等標(biāo)志著散射物質(zhì)的性質(zhì)。從這些資料可以導(dǎo)出物質(zhì)結(jié)構(gòu)及物質(zhì)組成成分的知識(shí)。這就是拉曼光譜具有廣泛應(yīng)用的原因。1940-1960年，拉曼光譜的地位一落千丈。主要是因?yàn)槔?yīng)太弱（約為入射光強(qiáng)的10-6），并要求被測(cè)樣品的體積必須足夠大、無(wú)色、無(wú)塵埃、無(wú)熒光等。40年代中期，紅外技術(shù)的進(jìn)步和商品化更使拉曼光譜的應(yīng)用一度衰落。（原始的拉曼光譜以汞弧燈為光源,用常規(guī)攝譜儀做色散系統(tǒng),出現(xiàn)的譜線極其微弱,限制了拉曼光譜的發(fā)展。）1960年以后，激光技術(shù)的發(fā)展使拉曼技術(shù)得以復(fù)興。由于激光束的高亮度、方向性和偏振性等優(yōu)點(diǎn)，成為拉曼光譜的理想光源。而過(guò)濾器的發(fā)展過(guò)濾掉瑞利散射，計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展使大數(shù)據(jù)分析成為可能。隨探測(cè)技術(shù)的改進(jìn)和對(duì)被測(cè)樣品要求的降低，目前在物理、化學(xué)、生物、工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域拉曼光譜得到了廣泛的應(yīng)用，越來(lái)越受研究者的重視。并且形成了一門光譜學(xué)的分支——拉曼光譜學(xué)。重要學(xué)術(shù)會(huì)議：國(guó)際拉曼光譜學(xué)大會(huì)(ThelnternationalConfer-enceonRamanSpectroscopy,ICORS)當(dāng)前第13頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)2.2拉曼(Raman)光譜基本原理透射光入射光散射光散射是光子與分子發(fā)生碰撞的結(jié)果拉曼光譜是研究分子和光相互作用的散射光的頻率當(dāng)前第14頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)瑞利（rayleigh）散射：

彈性碰撞；無(wú)能量交換，僅改變方向；拉曼（raman）散射：

非彈性碰撞；方向改變且有能量交換；Rayleigh散射Raman散射E0基態(tài)，

E1振動(dòng)激發(fā)態(tài)；

E0+h0

，

E1+h0

激發(fā)虛態(tài)；獲得能量后，躍遷到激發(fā)虛態(tài).

h

E0E1V=1V=0h0h0h0h(0

+

)E1+h0E0+h0h(0

-

)激發(fā)虛態(tài)當(dāng)前第15頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)Raman散射:Raman散射的兩種躍遷能量差：

E=h(0-

)產(chǎn)生stokes線；強(qiáng)；基態(tài)分子多；

E=h(0+

)產(chǎn)生anti-stokes線；弱；Raman位移：Raman散射光與入射光頻率差；ANTI-STOKES0-

RayleighSTOKES0+

0h(0

+

)E0E1V=1V=0E1+h0E2+h0

h

h0h(0

-

)當(dāng)前第16頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)

Stockslinesanti-StockeslinesRayleighscatteringCCl4的拉曼光譜

斯托克斯線和反斯托克斯線統(tǒng)稱為拉曼譜線。由于在通常情況下，分子絕大多數(shù)處于振動(dòng)能級(jí)基態(tài)，所以斯托克斯線的強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于反斯托克斯線。Δν/cm-1當(dāng)前第17頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)拉曼位移（Ramanshift）

Δv即散射光頻率與激發(fā)光頻之差。由于拉曼位移Δv只取決于散射分子的結(jié)構(gòu)而與vo無(wú)關(guān)，所以拉曼光譜可以作為分子振動(dòng)能級(jí)的指紋光譜。適用于分子結(jié)構(gòu)分析與入射光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)當(dāng)前第18頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)拉曼是指紋光譜ni=no-n(cm-1)50010001500200025003000350020000150001000050000Intensity(A.U.)OHstretchingCH3StretchingModesSkeletalBendingCCOmodesOHBendingCH3andCH2BendingModes甲醇vs.乙醇CH3OHvs.

CH3CH2OH當(dāng)前第19頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)對(duì)不同物質(zhì)Raman位移不同；對(duì)同一物質(zhì)與入射光頻率無(wú)關(guān)；是表征分子振-轉(zhuǎn)能級(jí)的特征物理量；是定性與結(jié)構(gòu)分析的依據(jù)；拉曼線對(duì)稱地發(fā)布在瑞利線兩側(cè)，長(zhǎng)波一側(cè)為斯托克斯線，短波一側(cè)為反斯托克斯線；斯托克斯線強(qiáng)度比反斯托克斯線強(qiáng)2.3拉曼光譜的特征

當(dāng)前第20頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)2.4拉曼光譜技術(shù)在植物學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)分辨率高（atthemicrometerlevel;<0.5um）由于激光束的直徑在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常規(guī)拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得到。而且,拉曼顯微鏡物鏡可以將激光束進(jìn)一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小體積的樣品。非損傷性測(cè)量（比如超薄切片用鋨酸）樣品用量少（ug級(jí)）由于激光束的直徑在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常規(guī)拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得。而且,拉曼顯微鏡物鏡可以將激光束進(jìn)一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小體積的樣品。

靈敏度高利用共振拉曼效應(yīng),可以用來(lái)有選擇性地增強(qiáng)大生物分子特個(gè)發(fā)色基團(tuán)的振動(dòng),這些發(fā)色基團(tuán)的拉曼光強(qiáng)能被選擇性地增強(qiáng)1000到10000倍。不受水溶液影響（水的紅外吸收非常強(qiáng)烈）固體樣品可直接測(cè)定，無(wú)需制樣當(dāng)前第21頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)2.5

適用于植物細(xì)胞壁研究的

拉曼光譜顯微技術(shù)傅立葉變換拉曼光譜分析技術(shù)(FTIR)共振拉曼光譜技術(shù)(RRS)表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SERS)針尖增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（TERS）共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)(CRM)受激拉曼散射光譜技術(shù)（SRS）相干反斯托克斯拉曼散射光譜技術(shù)（CARS）當(dāng)前第22頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)當(dāng)前第23頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)835cm-1:果膠多糖1541cm-1,1650cm-1可能有細(xì)胞質(zhì)蛋白1734cm-1，1240cm-1：木聚糖1629cm-1：非常復(fù)雜傅立葉變換拉曼光譜分析技術(shù)(FTIR)簡(jiǎn)介當(dāng)前第24頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)一個(gè)MCF-7細(xì)胞的Micro-Raman，以及隨后的定量分析(A&B)VisibleimageofanMCF-7cellandchemicalimagingspecificfortheintensityofCH–stretchingthroughoutthecell(8080pixelsanda0.5mmspotsize).(C)Hierarchicalclusteringofthespectralimagespecificforthe‘fingerprintregion’(1800–675cm1)displaysthelocalitiesofsub-cellularcomponents.Clustering可以用來(lái)量化亞細(xì)胞成分，就像細(xì)胞核,在這個(gè)細(xì)胞的例子里占了12%(768像素)Micro-Raman簡(jiǎn)介當(dāng)前第25頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)表面增強(qiáng)拉曼(SERS)簡(jiǎn)介優(yōu)勢(shì)：可以得到常規(guī)技術(shù)不易得到的信息什么是表面增強(qiáng)?

SERS效應(yīng)是在激發(fā)區(qū)域內(nèi)，由于樣品表面或近表面的電磁場(chǎng)的增強(qiáng)導(dǎo)致的拉曼散射信號(hào)極大的增強(qiáng)。怎么得到表面增強(qiáng)?

遠(yuǎn)小于激發(fā)波長(zhǎng)的金屬顆粒(Au,Ag)會(huì)使電磁場(chǎng)增強(qiáng)，增強(qiáng)的電磁場(chǎng)可以使在金屬顆粒表面的分子拉曼信號(hào)極大的增強(qiáng)激光激發(fā)了金屬表面的等離子體目前吸附分子產(chǎn)生表面增強(qiáng)拉曼散射的金屬有Ag、Au、Cu、Li、Na、K、In、Al、Pt、Rh、Ni|、Ti、Hg、Cd、Pd等，化合物有TiO2、NiO等當(dāng)前第26頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)當(dāng)前第27頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)針尖增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（TERS）簡(jiǎn)介掃描探針技術(shù)(SPM)當(dāng)前第28頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)當(dāng)前第29頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)當(dāng)前第30頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)相干拉曼散射顯微術(shù)（CARS&SRS）簡(jiǎn)介CARS優(yōu)勢(shì)：高靈敏度，高空間分辨率，高時(shí)間分辨率可以對(duì)脂類等小分子成像，重要的生命物質(zhì)脂類進(jìn)行觀察。（謝曉亮院士說(shuō)，因?yàn)槊绹?guó)人比較胖，所以……）可以通過(guò)選擇振動(dòng)光譜，對(duì)體內(nèi)特定小分子物質(zhì)如藥物，或者生物大分子如核酸蛋白質(zhì)進(jìn)行無(wú)需標(biāo)記的成像，是重要的活體成像手段可以進(jìn)行視頻速率的活體監(jiān)測(cè)可以很好的研究植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素的分布，有助于理解生物質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程中的各種處理與反應(yīng)的發(fā)生機(jī)理SRS優(yōu)勢(shì)：比CARS更靈敏，且可以完成定量分析1999年，謝曉亮實(shí)驗(yàn)室采用新的激光控制技術(shù)，使CARS顯微術(shù)走向?qū)嵱?009年，謝曉亮實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)出SRS顯微鏡，很大程度上彌補(bǔ)了CARS的不足當(dāng)前第31頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)CARS與SRS技術(shù)的創(chuàng)立者——謝曉亮，縱橫生命科學(xué)世界的華人美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士，哈佛大學(xué)終身教授，Nature雜志編委當(dāng)前第32頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)閔瑋，哥倫比亞大學(xué)教授。博后期間以第一作者發(fā)表有關(guān)SRS顯微技術(shù)當(dāng)前第33頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)CARStissueimageofsmalladipocytesofthesubcutaneouslayerfrommouseeartissue.TheimagewastakenataRamanshiftof2845cm-1toaddresstheCH2stretchingfrequency.當(dāng)前第34頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)RNAiscreeningofnewfatstorageregulatorygenesbasedoninvivolipidquantificationusinglabel-freeSRSmicroscopy.SRSimagesat2845cm-1forwild-typeworm(a),thedaf-2mutant(b),andthetransgenicwormintestinallyoverexpressingthelipase(c).(d)QuantificationoffatcontentbySRS(n=5worms)andthin-layerchromatography–gaschromatography.(e)SRSsignalincreasecomparedtothecontrolforgenesthatresultedinafatcontentincreaseofmorethan25%wheninactivatedbyRNAi(P<0.0001,n=5worms).當(dāng)前第35頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)

3拉曼光譜在植物細(xì)胞壁中的應(yīng)用細(xì)胞壁成分很復(fù)雜，是一種納米復(fù)合材料，微纖絲嵌入在不同基體復(fù)合物中（纖維素，果膠，木質(zhì)素），得到的光譜是多種物質(zhì)光譜的重疊。植物的形狀和機(jī)械強(qiáng)度由植物細(xì)胞壁決定，而植物細(xì)胞壁是由結(jié)構(gòu)組件在復(fù)雜組合而成。細(xì)胞壁必須能夠增長(zhǎng)，因此,細(xì)胞壁具有靈活性和彈性。細(xì)胞壁的功能特性不僅取決于細(xì)胞壁的聚合物組成,還在于聚合物大分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象,和從幾納米尺度(即規(guī)模略高于分子)到幾微米高度有序的架構(gòu)。而利用經(jīng)典的化學(xué)技術(shù)來(lái)處理細(xì)胞壁聚合物會(huì)讓這些細(xì)節(jié)丟失。因此光譜方法發(fā)揮了重要作用檢查植物細(xì)胞壁的原生狀態(tài)。不僅化學(xué)成分本身的利益,還構(gòu)造和組成與細(xì)胞壁層以及不同聚合物的取向和變形的變化。關(guān)于細(xì)胞壁的主體結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)完成,在接下來(lái)的重點(diǎn)將次要的植物纖維以及更細(xì)小更細(xì)節(jié)的部分。當(dāng)前第36頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)當(dāng)前第37頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)當(dāng)前第38頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)3.1微纖絲存在的技術(shù)難點(diǎn)：如果有合適的角度，拉曼光譜的強(qiáng)度取決于微纖絲之間的角度和激光偏振方向。改變激光偏振平行(0°)垂直于纖維軸(90°)會(huì)導(dǎo)致幾乎所有帶非常大的拉曼強(qiáng)度的變化，因此,在每一個(gè)植物細(xì)胞壁拉曼實(shí)驗(yàn)中,纖維方向(軸)和激光偏振調(diào)整在一個(gè)已知或者定義的角度。可以研究的內(nèi)容：可以由于纖維取向的改變?cè)斐傻膹?qiáng)度變化,由此發(fā)生不同的纖維素含量次生細(xì)胞壁內(nèi)的纖維素纖維與纖維軸變化之間的不同的壁層(S1-S2-S3),可以通過(guò)拉曼成像可視化觀察值得注意的纖維取向的變化往往對(duì)應(yīng)于纖維素結(jié)晶度的變化當(dāng)前第39頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)3.2細(xì)胞壁聚合物纖維素半纖維素較為復(fù)雜，而幸運(yùn)的是木質(zhì)素和果膠都有非常明顯的特征峰，因此可以利用拉曼光譜來(lái)研究。(圖示楊樹(shù)木材截面的拉曼圖像)當(dāng)前第40頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)3.3細(xì)胞壁分子的取向細(xì)胞壁組件是高度有組織的，可以通過(guò)激光平行和垂直于纖維軸來(lái)驗(yàn)證，而研究細(xì)胞壁分子的取向。R.H.AtallaandU.P.Agarwal,Science227(1985),636–638.當(dāng)前第41頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)3.5力學(xué)上的應(yīng)用監(jiān)測(cè)分子壓力在分子水平上的力學(xué)壓力監(jiān)測(cè)，給分子變形Experimentsondifferentcellwalltypesduringdeformationwillhelptodeepenthemicromechanicalunderstandingofplantcellwallsanditsmacromolecules.Thistechniquecanalsogiveimportantinsightsintothemicromechanicsofotherbiomaterials,e.g.ofspidersilkandofnewlycreatedbioinspiredcomposites.識(shí)別和定位植物代謝產(chǎn)物識(shí)別植物中的礦物質(zhì)當(dāng)前第42頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)3.6細(xì)胞壁毒理植物的環(huán)境毒理方面。具有代表性的是Kamnev等對(duì)植物根際細(xì)菌的重金屬培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),研究表明細(xì)菌的細(xì)胞壁或膜積累重金屬可以引起其拉曼譜線的變化,提示拉曼光譜技術(shù)在植物細(xì)胞壁環(huán)境毒理方面應(yīng)用具有可能性KamnevAA.JournalofMolecularStructure,2002,610(1-3):127-131.當(dāng)前第43頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)3.7細(xì)胞壁無(wú)標(biāo)記成像當(dāng)前第44頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)展望12014.3.2《NatureMethod》哥倫比亞大學(xué)prof.WeiMin(閔瑋)將受激拉曼散射顯微鏡技術(shù)，與一種小型但非常有活力的炔烴標(biāo)記（即C≡C，碳碳三鍵）相結(jié)合，C=C是一種化合物鍵，當(dāng)其拉伸時(shí)，會(huì)以獨(dú)特的“頻率”（不同于細(xì)胞內(nèi)的自然分子）發(fā)出強(qiáng)烈的拉曼散射信號(hào)?；罴?xì)胞全程可視化跟蹤生命過(guò)程SRS顯微鏡可捕獲小分子攜帶的C≡C鍵的獨(dú)特拉伸運(yùn)動(dòng)，生成活細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)分子的三維圖像閔瑋說(shuō)：“我們的新技術(shù)將開(kāi)啟用其他方式難以實(shí)現(xiàn)的、針對(duì)活細(xì)胞和動(dòng)物中一些生物小分子的許多研究。除了基礎(chǔ)研究，我們的技術(shù)還可能大大推動(dòng)轉(zhuǎn)化應(yīng)用。我相信SRS成像炔烴標(biāo)記能夠像GFP熒光團(tuán)熒光成像一樣，在大型物種中成像生物小分子?！碑?dāng)前第45頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)RRS可提供花青素糖基化修飾的典型光譜變化特征。這為次生產(chǎn)物的酶代謝調(diào)控機(jī)制研究提供了手段,植物次生代謝產(chǎn)物定位的無(wú)損分析較多集中在植物器官水平。那么，甲基化，磷酸化修飾的光譜變化特征？能否用拉曼光譜技術(shù)觀察甲基化磷酸化？展望2當(dāng)前第46頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)謝謝！請(qǐng)多多指教！當(dāng)前第47頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分1.纖維素纖維素(cellulose)是植物細(xì)胞壁的主要成分，它是由1000～10000個(gè)β-D-葡萄糖殘基以β-1,4-糖苷鍵相連的無(wú)分支的長(zhǎng)鏈。分子量在50000～400000之間。纖維素內(nèi)葡萄糖殘基間形成大量氫鍵，而相鄰分子間氫鍵使帶狀分子彼此平行地連在一起，這些纖維素分子鏈都具有相同的極性，排列成立體晶格狀，可稱為分子團(tuán)，又叫微團(tuán)(micellae)。微團(tuán)組合成微纖絲(microfibril)，微纖絲又組成大纖絲(macrofibril)，因而纖維素的這種結(jié)構(gòu)非常牢固，使細(xì)胞壁具有高強(qiáng)度和抗化學(xué)降解的能力。存在于細(xì)胞壁中的纖維素是自然界中最豐富的多糖。據(jù)推算，每年地球上由綠色植物光合作用生產(chǎn)的纖維素可達(dá)1011t之多，而1990年全球糧食產(chǎn)量只有2.2×109t。如何把纖維素轉(zhuǎn)化成為人類可利用的食物或者有效能源，是人們長(zhǎng)期渴望解決的重大課題！2.半纖維素半纖維素(hemicellulose)往往是指除纖維素和果膠物質(zhì)以外的，溶于堿的細(xì)胞壁多糖類的總稱。半纖維素的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，它在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與纖維素沒(méi)有關(guān)系。不同來(lái)源的半纖維素，它們的成分也各不相同。有的由一種單糖縮合而成，如聚甘露糖和聚半乳糖。有的由幾種單糖縮合而成，如木聚糖、阿拉伯糖、半乳聚糖等。半纖維素在纖維素微纖絲的表面，它們之間雖彼此緊密連接，但并非以共價(jià)鍵的形式連接在一起。因此，它們覆蓋在微纖絲之外并通過(guò)氫鍵將微纖絲交聯(lián)成復(fù)雜的網(wǎng)格，形成細(xì)胞壁內(nèi)高層次上的結(jié)構(gòu)。3.果膠類果膠物質(zhì)(pecticsubstances)也是細(xì)胞壁的組成成分。胞間層基本上是由果膠物質(zhì)組成的，果膠使相鄰的細(xì)胞粘合在一起。果膠物質(zhì)是由半乳糖醛酸組成的多聚體。根據(jù)其結(jié)合情況及理化性質(zhì)，可分為三類：即果膠酸、果膠和原果膠。(1)果膠酸果膠酸(pecticacid)是由約100個(gè)半乳糖醛酸通過(guò)α-1，4-鍵連接而成的直鏈。果膠酸是水溶性的，很容易與鈣起作用生成果膠酸鈣的凝膠。它主要存在于中層中。(2)果膠果膠(pectin)是半乳糖醛酸酯及少量半乳糖醛酸通過(guò)α-1，4-糖苷鍵連接而成的長(zhǎng)鏈高分子化合物，分子量在25000～50000之間，每條鏈含200個(gè)以上的半乳糖醛酸殘基。果膠能溶于水，存在于中層和初生壁中，甚至存在于細(xì)胞質(zhì)或液泡中。(3)原果膠原果膠(protopectin)的分子量比果膠酸和果膠高，甲酯化程度介于二者之間，主要存在于初生壁中，不溶于水，在稀酸和原果膠酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘墓z。果膠物質(zhì)分子間由于形成鈣橋而交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。它們作為細(xì)胞間的中層起粘合作用，可允許水分子自由通過(guò)。果膠物質(zhì)所形成的凝膠具有粘性和彈性。鈣橋增加，細(xì)胞壁襯質(zhì)的流動(dòng)性就降低；酯化程度增加，相應(yīng)形成鈣橋的機(jī)會(huì)就減少，細(xì)胞壁的彈性就增加。4.木質(zhì)素木質(zhì)素(lignin)不是多糖，是由苯基丙烷衍生物的單體所構(gòu)成的聚合物，在木本植物成熟的木質(zhì)部中，其含量達(dá)18%～38%，主要分布于纖維、導(dǎo)管和管胞中。木質(zhì)素可以增加細(xì)胞壁的抗壓強(qiáng)度，正是細(xì)胞壁木質(zhì)化的導(dǎo)管和管胞構(gòu)成了木本植物堅(jiān)硬的莖干，并作為水和無(wú)機(jī)鹽運(yùn)輸?shù)妮攲?dǎo)組織。5.蛋白質(zhì)與酶6.礦質(zhì)細(xì)胞壁的礦質(zhì)元素中最重要的是鈣。據(jù)研究，壁中Ca2+濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于胞內(nèi)，估計(jì)為10-5～10-4mol·L-1，所以細(xì)胞壁為植物細(xì)胞最大的鈣庫(kù)。鈣調(diào)素(calmodulin,CaM)在細(xì)胞壁中也被發(fā)現(xiàn)，如在小麥細(xì)胞壁中已檢測(cè)出水溶性及鹽溶性兩種鈣調(diào)素。當(dāng)前第48頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)激光器如具有30nm，351nm發(fā)射線的紫外激光器；Ar激光器一般在488.0nm,514.5nm等可見(jiàn)區(qū)發(fā)光；而Nd:YaG(釔鋁石榴石)激光器則在1064nm的近紅外區(qū)使用。試樣室發(fā)射透鏡使激光聚焦在樣品上收集透鏡使拉曼光聚焦在單色儀的入射狹縫單色儀儀器心臟1個(gè)光柵，2個(gè)狹縫減少雜散收光當(dāng)前第49頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)2.4拉曼光譜技術(shù)在植物學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)1、水的拉曼散射強(qiáng)度很微弱,生物大分子處于水溶液中，因此拉曼光譜是研究水溶液中的生物樣品和化學(xué)化合物的理想工具。2、拉曼一次可以同時(shí)覆蓋很廣波數(shù)的區(qū)間,可對(duì)有機(jī)物及無(wú)機(jī)物等多種物質(zhì)進(jìn)行分析。相反,若讓紅外光譜覆蓋如此廣闊的區(qū)域則必須改變各種器件的參數(shù),相比較而言程序復(fù)雜不具有通用性。3、拉曼光譜的譜峰清晰尖銳,適合定量研究以及運(yùn)用差異分析進(jìn)行定性研究。在化學(xué)結(jié)構(gòu)分析中,獨(dú)立的拉曼區(qū)間的強(qiáng)度和功能集團(tuán)的數(shù)量相關(guān)。當(dāng)前第50頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)生物分子鑒定拉曼光譜法對(duì)于蛋白質(zhì)中的酪胺酸可以測(cè)出它是埋藏在內(nèi)或暴露于外。如果酪胺酸是被埋藏在內(nèi)部，則它可做為強(qiáng)的氫鍵供給者（即提供氫原子給臨近的氫鍵接受者）。此時(shí)拉曼光譜上850cm-1/830cm-1的比值為0.5，即830cm-1的光譜峰較高。反之，若酪胺酸暴露在蛋白質(zhì)外部，則比值將升高，亦即850cm-1的光譜峰較高。當(dāng)前第51頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)同同屬分子振(轉(zhuǎn))動(dòng)光譜異：紅外分子對(duì)紅外光的吸收強(qiáng)度由分子偶極距決定異：拉曼分子對(duì)激光的散射強(qiáng)度由分子極化率決定紅外：適用于研究不同原子的極性鍵振動(dòng)－OH,－C＝O，－C－X拉曼：適用于研究同原子的非極性鍵振動(dòng)－N－N－,－C－C－互補(bǔ)當(dāng)前第52頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)同同屬分子振(轉(zhuǎn))動(dòng)光譜異：紅外分子對(duì)紅外光的吸收強(qiáng)度由分子偶極距決定異：拉曼分子對(duì)激光的散射強(qiáng)度由分子極化率決定紅外：適用于研究不同原子的極性鍵振動(dòng)－OH,－C＝O，－C－X拉曼：適用于研究同原子的非極性鍵振動(dòng)－N－N－,－C－C－互補(bǔ)當(dāng)前第53頁(yè)\共有61頁(yè)\編于星期三\5點(diǎn)O=C=O對(duì)稱伸縮O=C=O反對(duì)稱伸縮偶極距不變無(wú)紅外活性極化率變有拉曼活性極化率不變