護骨十五丸抗老年雌性大鼠骨質(zhì)疏松的效果

護骨十五丸抗老年雌性大鼠骨質(zhì)疏松的效果【摘要】目的評估藏藥護骨十五丸抗老年雌性大鼠骨質(zhì)疏松的效果。方法50只雌性22月齡老年大鼠，分為藏藥護骨十五丸大、中、小劑量治療組，雌激素治療組及老年模型組，連續(xù)給藥50d；另6月齡大鼠12只作為青年對照組。觀察各組實驗大鼠骨形態(tài)、骨密度、骨生物力學(xué)的改變。結(jié)果22月齡雌性大鼠可作為骨質(zhì)疏松的實驗?zāi)Ｐ停蛔o骨十五丸大劑量治療組可顯著增加骨松質(zhì)面積、骨皮質(zhì)指數(shù)，可顯著增加股骨骨密度、股骨的最大變形能力，減少骨鈣丟失。結(jié)論藏藥護骨十五丸對老齡雌性大鼠骨質(zhì)疏松有顯著改善或阻止骨質(zhì)疏松發(fā)展的作用，提示該制劑對女性絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松癥具有預(yù)防和治療作用。

【關(guān)鍵詞】骨質(zhì)疏松；老年；雌性大鼠；護骨十五丸

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是骨骼骨基質(zhì)和骨礦物質(zhì)喪失所致的一種骨代謝性疾病，以骨顯微結(jié)構(gòu)改變、單位骨體積骨量減少和骨生物力學(xué)改變?yōu)樘卣鳎?］。世界上骨質(zhì)疏松患者約達2億人，骨質(zhì)疏松癥成為危害老年人健康的重大公共衛(wèi)生問題。目前骨質(zhì)疏松癥的臨床治療多以西藥為主，如雌激素、降鈣素、鈣劑、維生素D、二磷酸類及氟化物等［2］，醫(yī)學(xué)上雖開發(fā)了較多抗骨質(zhì)疏松藥物，但仍未成為主導(dǎo)療法［3］。祖國醫(yī)學(xué)是一個豐富的寶藏,對骨質(zhì)疏松有豐富的論述，認(rèn)為腎虛是腰腿痛的根本原因，藏藥護骨十五丸系杜仲、續(xù)斷、乳香、沒藥、雪蓮花、西紅花等組成，有補腎壯腰、溫經(jīng)活血之功效。本實驗主要觀察藏藥護骨十五丸治療老年雌性大鼠骨質(zhì)疏松的效果，以期找到一種預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的有效藥物。

1材料1藥物

藏藥護骨十五丸系杜仲、續(xù)斷、乳香、沒藥、雪蓮花、西紅花等組成,本研究按動物實驗要求,取膠丸制備成供試藥物(自制)。2動物健康

純種SD大鼠62只，雌性，其中22月齡50只，體重g，6月齡大鼠12只，由西安交通大學(xué)動物中心提供。全部大鼠飼養(yǎng)條件一致，自由攝食，喂以大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用蒸餾水。

2方法

老齡大鼠骨質(zhì)疏松模型的選定

為能更確切模擬人類原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展過程，本實驗采用老齡未曾生育大鼠作為實驗動物模型。50只老齡未經(jīng)生育大鼠自然飼用常規(guī)飼料和蒸餾水22個月，作為老齡大鼠骨質(zhì)疏松實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

治療分組及治療時間

采用老齡大鼠實驗?zāi)Ｐ?，隨機分為5組：大劑量治療組10只；中劑量治療組11只；小劑量治療組9只；無措施22月老年模型組〔D組，g/kg,%(g/g)乳劑〕9只；己烯雌酚組〔E組，mg/kg,%乳劑〕11只；另6月齡大鼠12只作為青年對照組〔F組，g/kg，6%乳劑〕。其供試液溶劑大、中、小劑量組，老年模型組，己烯雌酚組，青年對照組均用伯洛沙姆制成%(g/g)乳劑，治療期為50d。

取材

實驗動物在20%烏拉坦溶液麻醉〔〕下,腹腔動脈抽血處死，取動物雙側(cè)后肢股骨、脛骨，分別固定于4%多聚甲醛中或放置于低溫冰箱固定和保存。備測骨鈣的股骨以紗布包裹后放置于低溫冰箱固定和保存。

觀察指標(biāo)與方法

組織形態(tài)學(xué)觀察

取股骨上段中1/2段,經(jīng)4%多聚甲醛固定，8％的中性EDTA脫鈣液脫鈣40d，常規(guī)石蠟包埋，用9%的多聚賴氨酸處理載玻片，切片，每張6μm，伊紅—蘇木素染色。

骨形態(tài)學(xué)測量股骨的石蠟切片經(jīng)HE染色后應(yīng)用北航醫(yī)學(xué)半自動彩色圖像分析系統(tǒng)分析測量。以關(guān)節(jié)軟骨下1mm的松質(zhì)骨區(qū)域，每張切片測量3個視野，取平均值，測量骨小梁相對面積。

骨皮質(zhì)厚度指數(shù)

取股骨中部橫斷面HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下測量計算骨皮質(zhì)厚度指數(shù)。計算方法

骨皮質(zhì)厚度指數(shù)＝AB+CD/AD

其中AB，CD，AD見圖1。

股骨鈣含量測定

取適量股骨精密稱重,置消化罐中,加混合酸(HNO3∶HClO4=4∶1)3ml,密閉后置烤箱中105℃消化2h,消化液取不同稀釋度分析各元素含量。鈣(Ca)采用Z-8000型塞曼偏振原子吸收分光光度計分析。鈣元素分析過程中的質(zhì)量控制用USEPA和粉質(zhì)發(fā)樣進行質(zhì)控，采取混合血樣控制。樣品處理過程中嘗試了灰化法、試管內(nèi)混合酸消化法,最終選擇了密閉消化罐消化,并做了回收實驗,回收率%～%。

骨礦密度(BMD)測定

用QDR-2000型HOLOJAC雙光子骨密度儀測量股骨骨礦密度,放射源為镅241Am,誤差≤3%。測量時，將各離體骨按一定順序放入有機玻璃盒內(nèi)，注入蒸餾水進行掃描。使用RegionalhighresolutionQDR4500小動物分析軟件。

骨生物力學(xué)測定

右股骨用微機控制電子萬能試驗機進行三點力學(xué)試驗，觀察最大應(yīng)力。當(dāng)外力作用于骨時，骨以形變產(chǎn)生內(nèi)部的阻抗即骨產(chǎn)生的應(yīng)力來抗衡外力用最大負(fù)荷力表示，單位為g/cm2。應(yīng)變是指骨在外力作用下的變形，大小等于骨受力后長度的變化量，用最大負(fù)荷表示，單位為厘米。測量時，調(diào)整兩個約束支架相距20mm,將兩個大鼠股骨比較均勻的部位放在兩個約束支架上，股骨的短軸與垂直方向平行，逐級加壓直至破壞，讀取導(dǎo)致破壞的負(fù)荷的數(shù)據(jù)。待測試件用生理鹽水保持濕潤，荷載測量精度為N，變形測量精度為mm。

統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)輸入計算機，用SPSSforwindows軟件進行t檢驗和方差分析，計算結(jié)果以±s表示，檢驗水準(zhǔn)α＝，P＜。

3結(jié)果

骨質(zhì)疏松大鼠模型骨形態(tài)學(xué)變化

股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨切片顯示，青年對照組骨小梁密度高而完整，排列規(guī)則；老年模型組骨小梁明顯稀疏，排列不整，骨小梁間隙增大，骨小梁面積比增大，老年模型組骨小梁密度、骨小梁面積顯著低于青年對照組(見表1)，證實骨質(zhì)疏松大鼠模型成立。表1實驗大鼠各組骨形態(tài)學(xué)測量結(jié)果比較

藏藥護骨十五丸對骨形態(tài)學(xué)的影響

表1示護骨十五丸大、中劑量治療組骨小梁密度顯著高于老年模型組，達到雌激素治療對照組水平，但上述各組均顯著低于青年對照組水平。大劑量治療組骨皮質(zhì)指數(shù)比顯著高于老年模型組，且達到青年對照組水平。護骨十五大劑量組增加骨小梁面積較增加骨皮質(zhì)指數(shù)比明顯。

各實驗組骨鈣含量比較各實驗組骨鈣含量

結(jié)果表明，護骨十五丸大、中、小劑量治療組大鼠股骨鈣含量與雌激素治療對照組之間無顯著性差異，但顯著高于老年模型組，低于青年對照組。表2實驗各組大鼠骨鈣含量和骨密度比較

股骨及椎體骨密度股骨骨密度測試

結(jié)果表明，護骨十五丸大劑量組顯著高于老年模型組，但仍顯著低于青年對照組；同時中、小劑量組與雌激素組、老年模型組之間無顯著性差異。椎骨骨密度測試結(jié)果表明，大、中、小劑量組與雌激素組、老年模型組之間無顯著性差異，均顯著低于青年對照組。

股骨生物力學(xué)骨生物力學(xué)測試

結(jié)果表明，護骨十五丸大、中、小劑量治療組與雌激素組骨最大負(fù)荷力無顯著性差異，均低于青年對照組。護骨十五丸大、中、小劑量治療組與雌激素組之間骨最大變形無顯著性差異，但高于老年模型組，低于青年對照組。表3實驗各組大鼠骨生物力學(xué)結(jié)果比較

4討論

本實驗結(jié)果顯示藏藥護骨十五丸可提高或改善骨質(zhì)疏松癥的骨顯微結(jié)構(gòu)、骨密度及股骨的最大變形，減少骨鈣丟失。

既往研究藥物治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的效果，均采用切除卵巢形成的去勢雌性大鼠作為模型［4］，但此種模型雖可較好的模仿人類婦女正常絕經(jīng)的骨丟失狀態(tài)，但去勢雌性大鼠股骨縱徑及股骨中軸的骨生物力學(xué)及骨密度不發(fā)生顯著性改變［5］，因此不符合人類自然衰老的狀態(tài)。伴隨著絕經(jīng)時間的增加，老年婦女的骨質(zhì)疏松既受絕經(jīng)因素的影響又受年齡因素的影響［6］。采用未經(jīng)生育的老年雌性大鼠作為骨質(zhì)疏松實驗?zāi)Ｐ?，可更好的模擬人類老年婦女的骨質(zhì)疏松癥的狀態(tài)，為研究藥物防治絕經(jīng)晚期婦女骨質(zhì)疏松癥提供較好的基礎(chǔ)。

在實驗中,為了客觀地評價藥物的效應(yīng),設(shè)立了3個對照組,分別為老年模型組、青年對照組、雌激素組(陽性藥物組)，藏藥護骨十五丸分為3個劑量組,來評價藥物的劑量效應(yīng)。實驗結(jié)果顯示,青年對照組和老年對照組有明顯差異,證實了模型的成功選擇。

藥效學(xué)實驗結(jié)果顯示,藏藥護骨十五丸可以治療和預(yù)防老年女性絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松癥，這與藏藥護骨十五丸的補腎壯腰、溫經(jīng)活血之功效是相符的。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)骨痿、骨痹的范疇，醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥之病機主要表現(xiàn)為脾腎虧、損氣滯血瘀和風(fēng)寒濕阻,其中脾腎虧盤損是內(nèi)因,氣滯血瘀與風(fēng)寒濕阻則為外因所致［7］。絕經(jīng)后婦女不僅腎衰髓減,而且脾氣亦衰，脾腎虛則氣血運行遲緩,脈絡(luò)不暢可致血瘀若遇外傷或感受風(fēng)寒濕邪,即易出現(xiàn)腰腿酸痛等一系列癥狀［8,9］。立方之關(guān)鍵在于標(biāo)本兼顧、攻補兼施,既要考慮脾腎不足而補之,又要顧及風(fēng)寒濕邪與外傷后導(dǎo)致氣滯血淤而攻之。杜仲、續(xù)斷補腎壯腰；乳香、沒藥活血散瘀、行氣舒筋；雪蓮花、西紅花祛風(fēng)寒濕邪，全方共奏補腎壯腰、溫經(jīng)活血之功效。

抗骨質(zhì)疏松的治療多通過提高骨密度，但抗骨質(zhì)疏松的最終目標(biāo)是提高骨生物力學(xué)、減少骨折發(fā)生率，尤其是股骨頸、椎體的骨折率［10］。用大、中、小3組劑量的藏藥護骨十五丸治療自然衰老的雌性骨質(zhì)疏松癥大鼠的結(jié)果表明，大劑量組可明顯改善股骨骨質(zhì)疏松的顯微結(jié)構(gòu)、骨密度及股骨的最大變形，減少骨鈣丟失，表明藏藥護骨十五丸可以通過改善骨的皮質(zhì)厚度、骨松質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)及增加骨密度多途徑而提高骨的生物力學(xué)性能，因此可以治療和預(yù)防老年女性絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松。

本實驗中雖然低、中劑量藏藥護骨十五丸對骨質(zhì)疏松的效果沒有達到統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，但仍能看出其對骨質(zhì)疏松具有劑量-效果效應(yīng)的趨勢，隨著給藥劑量的增加，改善骨質(zhì)疏松的效果越明顯，但其最佳有效劑量尚待進一步研究。

本實驗結(jié)果表明，藏藥護骨十五丸可以通過改善骨的皮質(zhì)厚度、骨松質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)及增加骨密度多途徑而提高骨的生物力學(xué)性能，提示藏藥護骨十五丸可治療和預(yù)防老年女性絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松。

【參考文獻】

［1］PabloJ.Enriori,CarlosL.Enriori.Thepathogenesisofosteoporosisinolderwomenandmen［J］.JournalofSteroidBiochemistry&MolecularBiology,2002,8:1.

［2］郭世紱.骨質(zhì)疏松癥的藥物治療及其理論基礎(chǔ)［J］.中華骨科雜志，2004,24(11）:691.

［3］李平生.骨質(zhì)疏松癥治療用藥最新進展［J］.中國處方藥，2005,1:39.

［4］MatthewJ.Silva,MichaelD.Brodt,BrianA.MorphologicalandmechanicalpropertiesofcaudalvertebraeintheSAMP6mousemodelofsenileosteoporosis［J］.Bone,2004,35:425.

［5］KenWatanabe,AkinoriHishiya.Mousemodelsofsenileosteoporosis［J］.MolecularAspectsofMedicine,2005,26:221.

［6］唐志榮,尹東，黃東,等.老年性骨質(zhì)疏松患者股骨近端骨質(zhì)量的改變.中國臨床康復(fù)，2005,3(9):200.

［7］王玲,哈孝賢,于順祿.骨丹對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥防治作用的實驗研究［J］.天津中醫(yī)藥，2004,21(5):398.

［8］林燕萍,周瑞祥,郭世明,等.健骨顆粒對去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨質(zhì)量的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,24(5):134.